一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，特别是涉及一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]阿洛酮糖是一种在自然界较为稀有的天然己酮糖，是一种功能性稀有糖，其分子式为C6H
12
O6，相对分子质量为180.16。阿洛酮糖为白色粉末状晶体，无味且不易吸潮，熔点为96℃，极易溶于水，在25℃时，阿洛酮糖在100g水中的溶解度为291g。阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70％，但是其热量值很低，小于1.6KJ/g，约是蔗糖热量的10％。
[0003]阿洛酮糖甜味及口感与蔗糖类似或接近，但其热量却远低于蔗糖，因此国内外专家预测阿洛酮糖将成为新一代健康、功能性甜味剂。除可作为蔗糖替代品外，阿洛酮糖具有独特的生理功能特性，阿洛酮糖有着抑制血糖升高、降血脂、抑制腹部脂肪堆积等保健特性，其潜在的保健价值逐渐被挖掘。阿洛酮糖在2011年被美国FDA批准为GRAS(公认安全)物质，2019年FDA将其从总糖和添加糖中排除，作为0糖甜味剂使用，经过国外十几年的产品研究和市场验证，美国食品行业评价阿洛酮糖为最具潜力的蔗糖替代品。
[0004]D
‑
阿洛酮糖3
‑
差向异构酶(D
‑
psicose3
‑
epimerase，简称DAEase或DPE)是酮糖3
>‑
差向异构酶家族中以D
‑
果糖为底物合成D
‑
阿洛酮糖的差向异构反应活性最高的异构酶，故DAEase是目前工业化生产D
‑
阿洛酮糖的关键用酶。
[0005]蛋白质定向进化指的是通过各种实验技术，在体外模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，通过突变和重组一个或多个亲本使基因发生变异，再通过对特定酶的特定功能或性质进行筛选，定向选择有价值的非天然蛋白分子。蛋白质定向进化大大加速了人类改造蛋白质原有功能和开发新功能的步伐，其广泛应用在与工业相关的酶催化方面。
[0006]由于来源于野生菌株未经改造的DAEase酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。中国专利CN113373135A通过定向进化获得发酵酶活提高的突变体，最适条件：温度55℃，pH8.0，0.1mMCo
2+
，阿洛酮糖转化率达到29％。中国专利CN103849612A利用基因突变技术获得突变体55℃半衰期是野生型的1.88倍。然而，催化活性高的DAEase酶的资源仍然很少，不利于D
‑
阿洛酮糖的普及推广。利用蛋白定向进化技术对野生型DAEase酶进行改造，以获得高活性的、适合工业应用的DAEase酶突变体，将是生物法制备D
‑
阿洛酮糖产业的关键。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术第一个问题是：提供一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体，将D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶亲本第79、115、141、193或202位氨基酸中的一个位点进行点突变得到的；
[0008]本专利技术所要解决的技术第二个问题是：提供一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体的制备方法，通过设计定点突变的突变引物，以携带D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因的载
体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体，然后转化进宿主细胞中表达得到D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体；
[0009]本专利技术所要解决的技术第三个问题是：提供一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体在阿洛酮糖生产中的应用。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术具体的技术方案是：
[0011]一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体，是将源于菌株Prolixibacteraceae bacterium的D
‑
阿洛酮糖3
‑
差向异构酶，氨基酸序列为序列表SEQ NO.1(NCBI登录号为MCK9413541.1)的序列分别在第79、115、141、193或202位氨基酸中进行一个点突变得到的；其中，突变体D79E为第79位氨基酸由天冬氨酸(Asp)变成谷氨酸(Glu)，突变体G115V为第115位氨基酸由谷氨酸(Gla)变成缬氨酸(Val)，突变体T141N为第141位氨基酸由苏氨酸(Thr)变成天门冬酰胺(Asn)，突变体E193D为第193位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天冬氨酸(Asp)，突变体R202K为第202位氨基酸由精氨酸(Arg)变成赖氨酸(Lys)。
[0012]一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体制备方法，包括以下步骤：
[0013]a.在D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶亲本氨基酸序列(NCBI登录号为MCK9413541.1)的基础上确定第79、115、141、193或202位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：
[0014]引入D79E突变的定点突变引物为：
[0015]正向引物：5
’‑
ATGATATCGCCTCCAATGAAGAAAGAATCAG
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0016]反向引物：5
’‑
TTTTGCCTGATTCTTTCTTCATTGGAGGCGA
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0017]引入G115V突变的定点突变引物为：
[0018]正向引物：5
’‑
TCTACAGTTCCTGGCCCGTGACCTTGCCAGC
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0019]反向引物：5
’‑
TCCCCGGCTGGCAAGGTCACGGGCCAGGAAC
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0020]引入T141N突变的定点突变引物为：
[0021]正向引物：5
’‑
TGAAAGAGGTGATGAAAAATGTTGAAGATTG
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0022]反向引物：5
’‑
ACATCGCAATCTTCAACATTTTTCATCACCT
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0023]引入E193D突变的定点突变引物为：
[0024]正向引物：5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体，其特征在于，是将NCBI登录号为MCK9413541.1的序列表SEQ NO.1的序列分别在第79、115、141、193或202位氨基酸中进行一个点突变得到的；其中，突变体D79E为第79位氨基酸由天冬氨酸变成谷氨酸，突变体G115V为第115位氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸，突变体T141N为第141位氨基酸由苏氨酸变成天门冬酰胺，突变体E193D为第193位氨基酸由谷氨酸变成天冬氨酸，突变体R202K为第202位氨基酸由精氨酸变成赖氨酸。2.如权利要求1所述的D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶突变体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a.在序列表SEQ NO.1D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶亲本氨基酸序列的基础上确定第79、115、141、193或202位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：引入D79E突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
ATGATATCGCCTCCAATGAAGAAAGAATCAG
‑3’
反向引物：5
’‑
TTTTGCCTGATTCTTTCTTCATTGGAGGCGA
‑3’
；引入G115V突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
TCTACAGTTCCTGGCCCGTGACCTTGCCAGC
‑3’
反向引物：5
’‑
TCCCCGGCTGGCAAGGTCACGGGCCAGGAAC
‑3’
；引入T141N突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
TGAAAGAGGTGATGAAAAATGTTGAAGATTG
‑3’
反向引物：5
’‑
ACATCGCAATCTTCAACATTTTTCATCACCT
‑3’
；引入E193D突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
TTCACATGAACATCGAAGATGATAATATTTA
‑3’
反向引物：5
’‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟杰，景栋，徐明，李海亮，陈京帅，张筱，
申请(专利权)人：山东盛泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：