本发明专利技术的目的在于提供一种使用低pH区域的pH稳定性高的阿洛酮糖生成酶来制造阿洛酮糖的方法。本发明专利技术是一种阿洛酮糖的制造方法，其包含如下工序：使如下多肽在小于pH6的酸性条件下作用于果糖，所述多肽是由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽或与序列号6表示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽且具有阿洛酮糖生成能力的多肽。具有阿洛酮糖生成能力的多肽。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】krungthepensis)。
[0018][5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，使细胞内包含编码具有阿洛酮糖生成能力的多肽的基因的微生物菌体与果糖接触。
[0019][6]一种酶剂，含有如下多肽作为有效成分，所述多肽是由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽、或与序列号6表示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽且具有阿洛酮糖生成能力的多肽。
[0020][7]一种酶剂，包含含有编码如下多肽的基因的微生物，所述多肽是由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽、或与序列号6表示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽且具有阿洛酮糖生成能力的多肽。
[0021][8]根据[6]或[7]的酶剂，其中，多肽来源于曼谷亚细亚菌(Asaia krungthepensis)。
[0022]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2020
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171513号的公开内容。
[0023]本专利技术的曼谷亚细亚菌来源的阿洛酮糖生成酶(AkDAE)在低于pH5的酸性区域也具有反应性。另外，在50℃以上的高温区域具有反应性。利用AkDAE生成阿洛酮糖时，能够防止褐变，且能够以高转化率生成阿洛酮糖。
附图说明
[0024]图1是示出利用曼谷亚细亚菌破碎液的阿洛酮糖生成试验的结果的图。
[0025]图2是示出AkDAE的最适pH的图。
[0026]图3是示出AkDAE的pH稳定性的图。
[0027]图4是示出AkDAE的最适温度的图。
[0028]图5是示出AkDAE的热稳定性的图。
[0029]图6是示出AkDAE的底物特异性的图。
[0030]图7是示出AkDAE的稀少糖转化率的图。
[0031]图8是示出AkDAE和公知的阿洛酮糖生成酶的中性pH和酸性pH条件下的反应性的比较结果的图。
[0032]图9是示出使用大肠杆菌的菌体的阿洛酮糖生成试验的结果的图。
具体实施方式
[0033]以下，对本专利技术进行详细说明。
[0034]本专利技术是一种使用曼谷亚细亚菌来源的阿洛酮糖生成酶(AkDAE)来制造阿洛酮糖的方法。
[0035]阿洛酮糖为具有化学式(I)表示的结构的单糖，被分类为酮糖。阿洛酮糖也被称为伪果糖(psicose)，由于天然存在的量很少，因此被称为稀少糖。
Center for Biological Information(美国国立生物学信息中心的基本局部比对搜索工具))等(例如，默认即初始设定的参数)进行计算时与序列号5所示的碱基序列所构成的DNA具有至少85％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步优选97％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的序列同一性的DNA且编码具有以果糖为底物生成阿洛酮糖的活性的蛋白质的DNA也包含于编码本专利技术的AkDAE的DNA中。
[0047]AkDAE的酶化学特性如下所述。
[0048](1)作用
[0049]AkDAE以果糖为底物生成阿洛酮糖。基于AkDAE的由果糖向阿洛酮糖的转化率在以30～60(w/v)％的果糖为底物的情况下为25％以上、优选为27％以上。
[0050](2)最适pH
[0051]AkDAE的最适pH为6～7，在pH5～10时具有最适pH时的活性的80％以上的活性。该最适pH为使用50mM乙酸缓冲液(pH4.0～6.0)、50mM磷酸缓冲液(pH6.0～7.0)、50mM Tris－HCl缓冲液(pH7.0～9.0)和50mM甘氨酸－NaOH缓冲液(pH9.0～11.0)进行测定时的值。
[0052](3)pH稳定性
[0053]AkDAE在pH4～10的范围为稳定的，即便在pH3～10的范围也在4℃24小时处理下残留60％以上的活性。在将pH7.0下的活性设为100％时，pH3.0的残留活性为60％以上，优选为65％以上。另外，在将pH7.0下的活性设为100％时，pH4.0的残留活性为90％以上，优选为95％以上。
[0054](4)最适温度
[0055]AkDAE的最适温度为55～65℃，在45～75℃具有最适温度的活性的80％以上的活性。最适温度为使用50mM Tris－HCl缓冲液pH7.0进行测定时的值。
[0056](5)热稳定性
[0057]AkDAE为耐热性的阿洛酮糖生成酶，在50℃以上的高温条件下处理1小时时，50℃、60℃的残留活性约为100％，70℃的残留活性为65％以上，优选为70％。
[0058](6)底物特异性
[0059]AkDAE以D
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果糖为底物时生成D
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阿洛酮糖，以D
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塔格糖为底物时生成D
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山梨糖。另外，AkDAE的差向异构酶活性为可逆反应。因此，以D
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阿洛酮糖为底物时生成D
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果糖，以D
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山梨糖为底物时生成D
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塔格糖。作为底物特异性，向D
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阿洛酮糖的反应性最高，向D
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果糖的反应性为60％。
[0060](7)稀少糖转化率
[0061]稀少糖转化率为计算酶反应达到平台期时的反应物与产物的比率所得的值。AkDAE的稀少糖转化率例如为D－Frc:D－All＝70.9:29.1，D－Tag:D－Sor＝69.4:30.6。
[0062](8)分子量
[0063]AkDAE的分子量为32.2kDa。
[0064]2.AkDAE的制造方法
[0065]AkDAE可以通过培养曼谷亚细亚菌，从培养液或菌体回收，进行纯化来制造。
[0066]培养条件、培养法只要可生产本酶，就没有特别限定。即，可以以可生产本酶为条件，适当地设定适于所使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养法，可以为液体培养、固体培养中的任一者，优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。
[0067]作为培养基，只要是所使用的微生物可繁殖的培养基，就没有特别限定。例如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源、以及硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦麸、肉提取物等氮源、以及钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。可以为了促进所使用的转化体的繁殖而将维生素、氨基酸等添加于培养基中。培养基的pH例如调节至约3～8、优选约4～7左右，培养温度通常约为20～40℃，优选约为25～35℃左右，有氧条件下培养1～10天、优选3～6天左右。作为培养法，例如可以利用振荡培养法、基于罐式发酵罐的有氧深部培养法。
[0068]在以上条件下进行培养后，从培养液或菌体回收目标酶。从培养液中回收时，例如可以通过将培养上清过滤、离心处理等而除去不溶物后，通过将基于超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制造阿洛酮糖的方法，其包含如下工序：使如下多肽在小于pH6的酸性条件下作用于果糖，所述多肽是由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽、或与序列号6表示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽且具有阿洛酮糖生成能力的多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中，小于pH6的酸性条件下为小于pH5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，作用于果糖时的温度条件为50℃～70℃。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，多肽来源于曼谷亚细亚菌即Asaia krungthepensis。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，使细胞内...
【专利技术属性】
技术研发人员：酒井杏匠，谷内宽之，结城健介，扫部正浩，
申请(专利权)人：天野酶制品株式会社，
类型：发明
国别省市：
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