一种葡萄糖醛酸C5-差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖醛酸C5

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法，以及利用所述细胞株分泌的人葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶，和利用所述人葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶生产肝素的方法。

技术介绍

[0002]作为一种特殊类型的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)，肝素(Hep)是目前在临床上使用历史最长的糖类药物(Nat Prod Rep，2009.26(3)：313
‑
21)。作为广泛使用的抗凝血药物，肝素主要用于手术和肾透析过程中预防静脉，动脉及肺部的血栓形成及其他血栓栓塞性疾病。在肝素发挥抗血栓/凝血作用的同抗凝血酶ATIII具有高亲和结合力的五糖序列基本单位中，艾杜糖醛酸(IdoA)的存在对于保持结构的柔性以及结合抗凝血酶的能力至关重要，GlcA转化为IdoA后的结合能力增加了2000倍以上(Trends Biotechnol.2001，19(9)：356
‑
62；Handb Exp Pharmacol，2012(207)：3
‑
22)。不同于在所有细胞表面表达的硫酸乙酰肝素，肝素主要在肥大细胞中表达，但两者具有相同的多糖骨架，并且享有共同的生物合成路线(Handb Exp Pharmacol，2012.207：23
‑
>41)。两者的主要区别在于Hep中硫酸化程度也更高，同时艾杜糖醛酸含量更高(＞80％)，(Annu Rev Biochem，2014.83：129
‑
57.)。负责肝素体内生物合成转化D
‑
葡萄糖醛酸(D
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GlcA)为L
‑
艾杜糖醛酸(L
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IdoA)的同样也是葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶(D
‑
glucuronyl C5
‑
epimerase，GLCE)。
[0003]目前肝素原料主要从猪小肠粘膜及牛肺中提取获得，然而由于动物来源肝素在提取工艺，质量控制方面存在问题，导致了2008年的“肝素钠事件”(Nat Prod Rep，2009.26(3)：313
‑
21；N Engl J Med，2008.358(23)：2457
‑
67)。生产非动物来源的肝素以取代这些动物组织中分离的传统模式已成为一种重要的发展趋势。其中使用微生物生产的肝素前体(Heparosan)进行诸如硫酸化和差向异构化反应的化学酶催化方法生产肝素是一种重要的很有前景的被认为是有可能替代的肝素制备方法(US11203772；US8227449；WO9614425；WO0246379；US2003023079；US2012322114；WO2018135027；Nat Prod Rep，2014.31(12)：1676
‑
85；Science，2011.334(6055)：498
‑
501；Carbohydr Polym，2015.122：399
‑
407)。
[0004]Heparosan是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N
‑
乙酰
‑
D
‑
葡萄糖胺(GlcNAc)的二糖重复结构[
→
4)
‑
β
‑
GlcA
‑
(1
→
4)
‑
α
‑
GlcNAc
‑
(1
→
]n
组成的多糖，它是某些细菌如E.coli K5的荚膜多糖中的一种成分。肝素结构中的L
‑
艾杜糖醛酸对于肝素发挥药理活性至关重要。因此，为了使肝素前体生产硫酸乙酰肝素及肝素，需要使部分己糖醛酸残基发生差向异构化反应，即，使部分D
‑
葡萄糖醛酸残基差向异构化为L
‑
艾杜糖醛酸的反应(葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构反应)，而该关键步骤反应需要使用GLCE来实现。
[0005]迄今已报道了多种哺乳动物来源的C5
‑
差向异构酶的利用(WO0246379；US8227449)，包括从直接从牛肝提取纯化的(蛋白已发生部分水解)(J Biol Chem 1994，269：26953
‑
8，70μg/4.5kg组织；WO9614425)，昆虫表达系统重组表达牛肺的
NO：6所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述标签为flag
‑
6XHis标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。在一个实施方式中，所述编码flag
‑
6XHis标签的核酸分子具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述信号肽和/或标签可以位于葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的N端。
[0013]在具体的实施方式中，将编码N端融合信号肽和/或标签的葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的核酸分子通过XhoI/BamHI双酶切位点插入慢病毒质粒pLVX
‑
IRES
‑
Puro慢病毒表达载体。
[0014]在具体的实施方式中，所述慢病毒表达载体进一步包含筛选标记。
[0015]本专利技术的第四个方面，提供一种制备重组人葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶(hGLCE)的细胞株的构建方法，其包括如下步骤：
[0016](1)将本专利技术第三个方面所述的表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞(优选为HEK293T细胞)，包装成携带编码葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的核酸分子的慢病毒；
[0017](2)用所述携带编码葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，得到制备重组hGLCE的细胞株。
[0018]在具体的实施方式中，步骤(1)中，包装质粒选自psPAX2和pMD2.G，或pRSV
‑
Rev和pMDLg/pRRE载体系统；优选地，包装质粒为psPAX2和pMD2.G。
[0019]在具体的实施方式中，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞的方法包括但不限于脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法等；在一个优选的实施方式，采用磷酸钙共沉淀。
[0020]在具体的实施方式中，步骤(2)中，可以通过筛选标记筛选得到生产重组hGLCE的细胞株。在具体的实施方式中，步骤(2)中，筛选方法可为：将所述携带编码葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染29本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。2.编码权利要求1所述葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。3.一种表达载体，其包含权利要求2所述的编码葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的核酸分子；优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体，选自pLVX
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IRES
‑
Puro、pLVX
‑
IRES
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Neo慢病毒质粒；优选地，所述慢病毒表达载体包含编码信号肽和/或标签的核酸分子；优选地，所述信号肽为IgG kappa分泌信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；更优选地，所述编码IgG kappa分泌信号肽的核酸分子具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；优选地，所述标签为flag
‑
6XHis标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；更优选地，所述编码flag
‑
6XHis标签的核酸分子具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；优选地，所述信号肽和/或标签位于所述葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的N端。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，将编码N端融合信号肽和/或标签的葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的核酸分子通过XhoI/BamHI双酶切位点插入慢病毒质粒pLVX
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IRES
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Puro慢病毒表达载体；优选地，所述慢病毒表达载体包含筛选标记。5.一种制备重组人葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的细胞株的构建方法，其包括如下步骤：(1)将权利要求3所述的表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞，包装成携带编码葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的核酸分子的慢病毒；(2)用所述携带编码葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，得到制备重组人葡萄糖醛酸C5
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差向异构酶的细胞株。6.根据权利要求5所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5
‑
差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，包装质粒选自psPAX2和pMD2.G，或pRSV
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Rev和pMDLg/pRRE载体系统；优选地，包装质粒为自psPAX2和pMD2.G；优选地，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞(优选为HEK293T细胞)的方法包括但不限于脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以...

【专利技术属性】
技术研发人员：方建平，魏娜，陈炫谷，
申请(专利权)人：上海兴糖生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：