一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体


[0001]本专利技术涉及一种D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体，属于酶工程


技术介绍

[0002]D
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阿洛酮糖是D
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果糖的C
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3差向异构体，是当前研究最热的稀少糖。D
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阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，能量值却只有蔗糖的10％，是理想的蔗糖替代品。此外，D
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阿洛酮糖具有多种优良的生理学功能，包括预防肥胖症、降低血糖、降低血脂、抗龋齿、抗氧化、治疗糖尿病和动脉粥样硬化疾病等。此外，在食品中添加D
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阿洛酮糖还可以提高凝胶特性，并且通过美拉德反应改善食品的风味。目前，D
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阿洛酮糖已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为普遍公认安全类食品(GRAS)，并且FDA在2019年允许D
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阿洛酮糖在食品标签中不计入总糖和添加糖含量。
[0003]D
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阿洛酮糖可以通过化学法合成，但存在反应条件苛刻、产物分离困难、化学污染等问题。相对于化学合成，生物转化法具有反应条件温和、环境友好、高度特异性等优点，D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶(DAEase)能够催化D
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果糖发生C
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3位置的差向异构化反应，直接生成D
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阿洛酮糖，是目前最为高效和常见的D
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阿洛酮糖生产方法。
[0004]由于已报道的大多数DAEase热稳定性较差，难以满足工业实际应用的需求，国内外已开展针对DAEase热稳定性提升的分子改造研究，主要是基于蛋白融合技术和理性设计手段，包括温度因子(B
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factor)分析、二硫键设计、亚基界面相互作用分析和计算机辅助折叠自由能(ΔΔG
Fold
)计算等。
[0005]定向进化技术是酶功能强化的有效方法，但其在DAEase分子改造中的应用潜力还没有被充分挖掘，其主要瓶颈在于缺少快速高效的筛选方法。现有的DAEase高通量筛选方法，存在操作复杂、筛选成本高等问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术利用D
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果糖和D
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阿洛酮糖在酸性Si(IV)
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Mo(
Ⅵ
)显色液中还原能力的差异，建立了基于比色定量的高通量筛选方法，有效偶联DAEase突变体基因型与表型。本专利技术还提供了利用所述筛选方法，以来源于微生物Clostridium cellulolyticum的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶为亲本，经过多轮定向筛选获得的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶四点突变体，其热稳定性和酶活性都得到了增强。
[0007]本
技术实现思路
的目的是提供一种D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法以及热稳定性和酶活性增强的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶四点突变体、编码基因、重组载体和基因工程菌。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种基于比色定量的D阿洛酮糖3差向异构酶突变体
文库的高通量筛选方法，具体步骤如下：
[0010]1)以DAEase编码基因作为突变模板，基于易错PCR方法，使用低保真DNA聚合酶(rTaq，同时加入Mn
2+
(0.1mM)和Mg
2+
(6mM)产生和调节突变率，获得DAEase的随机突变文库，然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；
[0011]2)将步骤1)得到的发酵液离心获取菌体沉淀，然后加入裂解液(含1mg/mL溶菌酶和1μL/mL DNase I)破碎细胞，将破碎后的细胞液离心取上清作为粗酶液，经60℃热处理10min后进行酶反应；所述酶反应为，将所述粗酶液添加至含有D
‑
果糖的反应体系中，催化D果糖生成D阿洛酮糖；
[0012]3)酶反应10min后，加入4倍体积的Si(IV)
–
Mo(
Ⅵ
)显色液，在70℃下加热30min显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值。将野生型或出发型DAEase的平均酶活设为相对酶活100％，认定相对酶活大于120％的突变体为正向突变体。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体，所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本酶D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的第38，42，70，119位氨基酸一个或多个进行突变得到的。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶来源于Clostridium cellulolyticum。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述亲本酶D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第38位丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位丙氨酸突变为脯氨酸和第119位苏氨酸突变为脯氨酸，命名为S38F/F42N/A70P/T119P。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0019]本专利技术的第三个目的是提供编码所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的基因。
[0020]本专利技术的第四个目的是提供携带所述突变体基因的重组载体。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体以pET28a为表达载体。
[0022]本专利技术的第五个目的是提供表达所述突变体S38F/F42N/A70P/T119P的基因工程菌。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体，其特征在于，所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的第38位丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位苏氨酸突变为脯氨酸得到的。2.权利要求1所述的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为基于比色定量的高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的编码基因为突变模板，通过易错PCR方法构建DAEase的随机突变文库；然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；(2)将步骤(1)得到的发酵液离心获取菌体沉淀，然后加入裂解液破碎细胞，将破碎后的细胞液离心取上清作为粗酶液，经60℃热处理后进行酶反应；所述酶反应为，将所述粗酶液添加至含有D
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果糖的反应体系中，催化D果糖生成D阿洛酮糖；(3)酶反应结束后，加入Si(IV)
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Mo(
Ⅵ
)显色液，在70℃下加热显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值；将野生型D
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阿...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，张文立，陈佳俊，徐炜，朱莺莺，倪大伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：