七叶树2,3-氧化鲨烯环化酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了七叶树2,3

【技术实现步骤摘要】
metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae via an integrated strategy[J]. Microbial cell factories,2019,18(1);95.）。
[0005]虽可以从七叶树的果实娑罗子中直接提取七叶皂苷，但由于七叶树野生资源有限，人工栽培周期较长，导致七叶皂苷资源供应紧张，因此迫切需要解析七叶皂苷生物合成途径，为七叶皂苷的合成生物学研究以及高产七叶皂苷的七叶树新品种提供关键的基因元件。

技术实现思路

[0006]β
‑
香树脂醇合成酶催化了七叶皂苷合成途径的关键步骤，此酶的鉴定将为七叶皂苷生物合成途径的整体解析起到极大的促进作用，并为其生物合成提供理论基础。
[0007]有鉴于此，本专利技术的主要目的是提供七叶树2,3
‑
氧化鲨烯环化酶及其编码基因与应用。
[0008]本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β
‑
香树脂醇合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。
[0009]所述β
‑
香树脂醇合成酶活性是催化2,3
‑
氧化鲨烯合成β
‑
香树脂醇。
[0010]所述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。
[0011]所述编码基因为如下1)或 2) 或 3)所示：1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3) 与1)或 2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性的DNA分子。
[0012]将该基因命名为AcOSC6，将其编码的蛋白命名为AcOSC6。具体信息如下：AcOSC6基因序列如序列表中序列1所示，其含有2298个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由765个氨基酸组成。
[0013]含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。
[0014]所述蛋白在作为β
‑
香树脂醇合成酶中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0015]所述β
‑
香树脂醇合成酶活性是催化2,3
‑
氧化鲨烯合成β
‑
香树脂醇。
[0016]所述蛋白、所述编码基因在催化2,3
‑
氧化鲨烯合成β
‑
香树脂醇中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0017]本专利技术基于七叶树叶、枝、花、外果皮、种仁不同组织部位的高通量测序以及七叶皂苷次生代谢产物的相关结果，用基因共表达分析的方法找到并鉴定催化β
‑
香树脂醇合成的关键酶，为七叶皂苷的生物合成和高产七叶皂苷的七叶树新品种培育提供关键基因和蛋白编码序列。
[0018]本专利技术主要通过转录组和代谢组联合分析，获得β
‑
香树脂醇合成酶的基因序列，再通过烟草瞬时转化系统，确认AcOSC6能催化2,3
‑
氧化鲨烯合成β
‑
香树脂醇。能够在本氏烟草活体叶片中表达β
‑
香树脂醇合成酶基因，异源合成β
‑
香树脂醇，为七叶皂苷的合成提
供新思路。七叶树2,3
‑
氧化鲨烯环化酶的鉴定也将极大地推进七叶皂苷的生物合成，为其成为新药提供充足的原料。
附图说明
[0019]为了说明而非限制的目的，现在将根据本专利技术的优选实施例、特别是参考附图来描述本专利技术，其中：图1为2,3
‑
氧化鲨烯和β
‑
香树脂醇的分子结构式。
[0020]图2为七叶树不同组织部位七叶皂苷代谢产物含量变化图。
[0021]图3为AcOSC6基因克隆和载体构建结果胶图。
[0022]图4为AcOSC6注射烟草产物鉴定GC
‑
MS图。
具体实施方式
[0023]实施例1、克隆七叶树2,3
‑
氧化鲨烯环化酶的编码基因一、基因克隆的方法和步骤首先，将七叶树的叶、枝、花、外果皮和种仁在液氮中研磨成粉末，利用甲醇提取，料液比1:10，通过LC
‑
QQQ
‑
MS（Agilent1290，6470 QQQ）)对七叶皂苷A、七叶皂苷B以及七叶皂苷总含量进行检测。色谱柱为 Agilent Eclipse Plus C18 column (RRHD 1.8μm, 2.1
×
50mm)，流动相包括色谱级0.1%乙酸
‑
乙腈（A）和0.1%乙酸
‑
水（B），等度洗脱程序，流速0.3 mL/min，柱温 35℃，检测波长 203 nm，进样量 1 μL。质谱仪选择正或负离子模式下，与鞘气体温度为 250
°
C,气流在 11.0 L / min，喷雾器气体在 40 psi。毛细管电压设为 4000 V，喷嘴电压设为 500 V，EMV(+)设为 200 V。采用多重反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式检测代谢物，每种化合物选择两个前体产物离子 MRM 转移(一个用于定量，另一个用于鉴定)，使用外标法进行定量分析。使用 MassHunter (version B.07.00)获取数据并进行分析。发现花和种仁中七叶皂苷A、七叶皂苷B以及七叶皂苷总含量最高，尤其种仁中三种七叶皂苷以及七叶皂苷总含量均最高（图2）。
[0024]在七叶树基因组测序基础上，利用生物信息学技术在七叶树基因组中注释出2,3
‑
氧化鲨烯环化酶基因，利用Illumina平台对七叶树不同组织进行RNAseq，转录组数据基因表达分析结果表明AcOSC6在种仁中特异性高表达，与七叶皂苷含量变化规律一致（表1）。
[0025]采集七叶树成熟的种子，利用RNA提取试剂盒（艾德莱，RN38 EASYspin plus）提取七叶树种子中的RNA，RNA质量检测合格后进行反转录获得质量合格的cDNA。设计引物序列（如表2），以种仁的cDNA为模板，利用KOD
‑
Plus
‑
Neo高保真酶克隆到AcOSC6基因片段（KOD高保真酶PCR体系总体积为50 μL：5 μL 10
Ⅹ
Buffer，3 μL MgSO4，5 μL dNTP（2mM），1.5 μL 正向引物（10μM），1.5 μL 反向引物（10μM），1 μL 模板，1 μLKOD酶和32 μL水，程序如表3）。
借助pEASY
‑
Blunt载体（全式金，pEASY
®‑
Blunt Cloning Vector），成功将AcO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β
‑
香树脂醇合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述β
‑
香树脂醇合成酶活性是催化2,3
‑
氧化鲨烯合成β
‑
香树脂醇。3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或 2) 或 3)所示：1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2) 在严格条件下与...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟强，孙伟，万会花，熊超，孟祥霄，曹雪，王思凡，徐志超，陈士林，尹青岗，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：