SspDnaB内含肽及其在表达分离透皮肽中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新的Ssp DnaB内含肽，其序列如SEQ ID No.5所示。还公开了一种DnaB

【技术实现步骤摘要】
Ssp DnaB内含肽及其在表达分离透皮肽中的应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程
，特别涉及一种Ssp DnaB内含肽及其在表达分离透皮肽中的应用。

技术介绍

[0002]小分子多肽的合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成是利用固相或者液相介质，将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成，但是对于长一点的多肽的合成，就会出现反应步骤多，副产物和中间产物多，产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术，将多肽融合蛋白表达在宿主内部，再经过蛋白纯化和多肽释放来获得目的多肽。这种方法的优势是不受多肽长度和氨基酸序列的影响，可以简单高效地合成多肽，副产物少，也是目前工业上合成多肽的重要方法。但生物合成的方法还是需要经过菌株破碎和蛋白纯化的步骤，极大地提高了多肽的生产成本，也降低了多肽的合成规模，是多肽生物合成的重要限速步骤。因此，开发免菌体破碎和蛋白纯化的多肽生产工艺和提高多肽的表达效率，对于多肽的工业化生产而言，具有重要的价值。
[0003]传统促透剂易产生皮肤过敏和炎症、浓度高有毒性、对大分子无效需仪器辅助的缺点，物理促透法成本高，不便携带，长期使用易导致角质层变薄、易引起皮肤感染。生物促透技术是利用一类具有皮肤穿透能力的多肽分子，约10～30个氨基酸，可有效促进大分子透皮。透皮肽具有无刺激性、不会导致皮肤过敏及损伤、药物与材料有良好的相容性、具有稳定的理化性质、起效时间快、作用时间长。透皮肽种类很多，TAT以其低毒性及高细胞穿透性应用最为广泛。且主链环化有助于提高易位能力。
[0004]透皮肽生物合成后纯化困难，现有的纯化条件纯化透皮肽效率不高，纯化量少且非特异带很多，很难进行后续的鉴定及透皮效果实验。
[0005]蛋白质的分离纯化工作较为复杂，从细胞中提取的蛋白质或从含有蛋白质的溶液中经过沉淀、梯度离心、盐析等方法得到的蛋白质经常含有杂质，要去除这些杂质，同时又要保持蛋白质的生物学活性。
[0006]亲和层析是最常用于蛋白纯化的方法。其基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。本方法存在的问题是：单抗非常昂贵，而且也需先纯化；单抗与目的蛋白结合力太强.要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合；某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。亲和柱通常在纯化过程的后期应用，此时标本体积已缩小，大部分的杂质已经去除。
[0007]谷胱甘肽S
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转移酶(Glutathione S
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transferase，GST)是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适地折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形
成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
[0008]另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点，首先，由于只有6个氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
[0009]目的蛋白大多会与蛋白标签一起融合表达，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。一般为了不影响目的蛋白的后续使用，都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点，这样表达纯化的得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除，得到完整的目的蛋白。常用的蛋白酶切位点有：HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。虽然这些酶切位点特异性都比较高，但切割效率各不相同，常用的蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。且蛋白酶的酶切效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响。综合考虑这些因素增加了载体设计的难度与复杂性，获得纯度高有活性的蛋白需要很大的工作量和成本。
[0010]内含肽的剪接反应是一个不需要酶催化的自发进行的过程。它是经4步亲核反应完成的，包括：1)N
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S酰基重排；2)转酯反应；3)末位氨基酸Asn环化；4)S
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N酰基重排。与其他亲和纯化系统(如免疫亲和层析、金属螯合亲和层析)相比，内含肽介导的亲和纯化系统可以诱导断裂反应的发生，使其在纯化的过程中除去纯化标签并得到不含任何外来序列的目标蛋白。同时，也避免了使用其他手段除去纯化标签的麻烦。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种Ssp DnaB内含肽，其序列如SEQ ID No.5，具有很高的内含肽自切割活性，尤其适合于制备氨基酸数量在50以下的小分子多肽。
[0012]本专利技术还公开了一种DnaB
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cTAT融合蛋白，其序列如SEQ ID No.1所示，通过内含肽自切割系统，可以高效表达和分离cTAT，降低cTAT的生产成本。
[0013]本专利技术还公开了上述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白的编码基因，其序列如SEQ ID No.2所示。
[0014]本专利技术还公开了一种pET28a
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DnaB
‑
cTAT表达质粒，表达上述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白。
[0015]本专利技术还公开了上述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白的原核表达载体。
[0016]优选的，系上述的pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌而成。
[0017]本专利技术还公开了一种cTAT的表达分离方法，其特征在于其步骤包括：
[0018](1)构建pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒；
[0019](2)将pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌；选出阳性克
隆；
[0020](3)培养阳性克隆，诱导cTAT的表达；
[0021](4)分离纯化cTAT。
[0022]优选的，步骤(1)中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Ssp DnaB内含肽，其特征在于其序列如SEQ ID No.5所示。2.权利要求1所述的Ssp DnaB内含肽在表达分离小分子多肽中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述小分子多肽的氨基酸数量在50以下。4.一种DnaB
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cTAT融合蛋白，其特征在于其序列如SEQ ID No.1所示。5.权利要求4所述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白的编码基因，其序列如SEQ ID No.2所示。6.一种pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒，其特征在于表达权利要求4所述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白。7.权利要求4所述的DnaB
‑
cTAT融合蛋白的原核表达载体。8.根据权利要求4所述的原核表达载体，其特征在于系权利要求6所述的pET28a
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DnaB
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cTAT表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌而成。9.一种透皮肽cTAT的表达分离方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒；(2)将pET28a
‑
DnaB
‑
cTAT表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；(3)培养阳性克隆，诱导cTAT的表达；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志乾，张珅，江翱，王嘉鹏，林玉书，邱益，吴奕瑞，王海梅，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：