内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法技术

本发明专利技术公开了一种内含肽ChiATP，其氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。还公开了内含肽ChiATP

【技术实现步骤摘要】
内含肽ChiATP、内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白及二肽
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2的表达方法


[0001]本专利技术涉及一种内含肽ChiATP、内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白及二肽
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2的表达方法。

技术介绍

[0002]二肽
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2是由缬氨酸和色氨酸两个氨基酸分子键合而成的小分子活性肽，因其具有皮肤调理、保湿、抗氧化等功效，广泛应用于化妆品、护肤品等领域。二肽
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2是一种有效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，可以通过抑制血管紧张素I转换为血管紧张素II，从而改善眼部血液循环，促进水分排出，在快速祛除眼袋的同时，还能够紧致调节皮肤而平滑皱纹。二肽
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2几乎无副作用，没有致痘性，可以安全作为化妆品、护肤品等产品的添加活性物质。目前，二肽
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2一般采用生物催化或者化学合成等方法生产，例如有研究报道利用histagged蛋白连接酶在pH＝8的缓冲溶液中，37℃下催化L
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缬氨酸和L
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色氨酸反应16小时获得二肽
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2；通过Cbz保护的缬氨酸，经双(五氟苯基)碳酸酯活化，再与色氨酸钠盐反应得到Cbz保护的二肽
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2，最后经催化氢解得到二肽
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2。酶法催化或化学合成方法存在成本较高、反应条件苛刻、副反应多等问题，不利于大规模工业化生产。并且二肽
‑/>2分子量小，存在分离提纯难、操作复杂、成本高等问题，进一步阻碍了二肽
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2的生产应用。
[0003]分子生物学技术的发展极大的促进了合成生物学领域的拓展，通过对天然微生物基因表达系统的改造，可以实现外源肽类的高效表达，微生物合成技术有望取代酶法催化和有机合成方法制备多肽类物质。肽类的生物合成技术存在诸多的优势：1)无复杂多步合成步骤，通过分子生物学技术构建表达目的蛋白的基因工程菌，就可以持续的进行肽类的表达生产；2)成本低、操作条件温和，参与合成的底物都是一些最基础的营养物质，不需要昂贵的材料和反应装置；3)副产物少、提纯容易，基本没有合成副产物，不引入新的合成中间体，只有生命体代谢的产物，容易分离和提纯；4)对环境友好、可持续发展，助力“碳中和”目标的实现。5)合成效率高，产品得率高，易于实现多肽大规模生产制备。
[0004]但是，目前还没有通过工程微生物生产制备二肽
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2的案例。
[0005]二肽
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2因其分子量小，直接表达的方式难以在微生物发酵产物中分离纯化和检测。可通过构建包含自切割位点寡肽的融合基因，提高肽链的长度，使其易于在表达过程中检测寡肽的产量，并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。内含肽的发现和改造能够有效地应用于短肽的融合表达和纯化。内含肽是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自剪接功能将内含肽两端的外显肽以肽键连接，同时将自身从前体蛋白中释放出来。内含肽在生物技术应用中应用广泛，包括蛋白质连接、蛋白质环化、蛋白质标记、毒性蛋白表达、研究体内蛋白质互作等。利用内含肽及其变体介导肽链纯化并在大规模多肽生产中应用也日益受到关注。因此，本领域需要提供一种通用、易于操作、成本低廉获取二肽
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2的方法。
[0006]在本专利技术中，一种内含肽介导的二肽
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2表达和分离纯化技术。将通过自主设计的
内含肽与二肽
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2组成融合蛋白，将融合蛋白基因序列构建到PET
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28a(+)上，获得二肽
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2的重组表达载体。再经过诱导表达、细胞破碎、超滤、内含肽自切割、二次超滤和旋蒸冻干等简单的步骤，可以高效地获得高纯度的二肽
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2。这种生物合成方法适用于二肽
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2的工业化生产，具有较大的市场价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术公开了一种内含肽ChiATP，其氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。
[0008]本专利技术还公开了上述的内含肽ChiATP的编码基因，其DNA序列如SEQ ID No.1所示。
[0009]本专利技术还公开了一种内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID:No.4所示。
[0010]本专利技术还公开了上述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.3所示。
[0011]本专利技术还公开了上述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的表达载体。
[0012]优选的，所述表达载体为PET28a。
[0013]本专利技术还公开了上述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的表达宿主菌。
[0014]优选的，所述表达宿主菌为大肠杆菌。
[0015]本专利技术还公开了一种二肽
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2的表达方法，其步骤包括：
[0016](1)构建上述的表达载体；
[0017](2)将表达载体转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；
[0018](3)培养阳性克隆，诱导二肽
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2的表达；
[0019](4)分离纯化二肽
‑
2。
[0020]优选的，步骤(4)具体为：
[0021]4.1收集阳性克隆的菌体细胞并进行细胞破碎，离心，取细胞破碎后的上清液稀释后进行超滤，收集浓缩液，其中含有内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白；
[0022]4.2加入自切割反应缓冲液，诱导内含肽的N端发生断裂反应，得到内含肽ChiATP和二肽
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2的混合物；
[0023]4.3进行二次超滤，收集滤出液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯化后的二肽
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2。
[0024]优选的，所述自切割反应缓冲液包括：pH6.4的Tris缓冲液，40mM Bis
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Tris，0.5mM EDTA。
[0025]优选的，步骤4.3采用3KDa滤膜进行超滤。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种全新的内含肽ChiATP，该内含肽具备了普通内含肽的要求,如具有结构域,具有自剪接功能,具有温度敏感性等特征。通过实验验证此内含肽可以达到已报道内含肽的效果,成功将目标蛋白表达出来。该内含肽分子量约为15KDa，与目标肽(分子量约0.3KDa)分子量差距较大,因此通过两次超滤即可将其去除，从而得到较纯的目的蛋白。该内含肽及基于内含肽的蛋白表达纯化方法解决了传统蛋白纯化需要加入Tag形成融合蛋白,再通过亲和层析获得纯化蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内含肽ChiATP，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。2.权利要求1所述的内含肽ChiATP的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.1所示。3.一种内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID:No.4所示。4.权利要求1所述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.3所示。5.权利要求3所述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的表达载体。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为PET28a。7.权利要求3所述的内含肽ChiATP
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二肽
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2融合蛋白的表达宿主菌。8.根据权利要求7所述的表达宿主菌，其特征在于所述表达宿主菌为大肠杆菌。9.一种二肽
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2的表达方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建权利要求4或5所述的表达载体；(2)将表达载体转化到大肠杆菌宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海梅，张志乾，江翱，王帆，吴奕瑞，崔华，郭羽，邱益，傅玮，王嘉鹏，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：