可控拷贝数的突变质粒及其在噬菌体辅助进化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可控拷贝数的质粒，包含ColE1复制子，且在ColE1复制子的启动子下游插入操纵子。还公开了一种可控拷贝数的突变质粒，表达造成DNA损伤和低保真修复的酶，突变质粒包含ColE1复制子，且在复制子的启动子下游插入cumate操纵子。还公开了突变质粒在噬菌体辅助进化中的应用，及噬菌体辅助进化体系。本发明专利技术利用噬菌体诱导启动子来控制突变质粒的拷贝数，同时利用噬菌体诱导启动子来诱导突变基因的表达，既可以保证未受噬菌体侵染的宿主菌中突变质粒的拷贝数较低、突变基因的表达受到抑制，防止无意义的背景突变，又能在噬菌体侵染宿主菌后扩大突变质粒的拷贝数、开启突变基因的表达，有效提高噬菌体基因组的进化效率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
可控拷贝数的突变质粒及其在噬菌体辅助进化中的应用


[0001]本专利技术涉及一种可控拷贝数的突变质粒及其在噬菌体辅助进化中的应用，以及相应的噬菌体辅助进化体系，属于基因进化


技术介绍

[0002]质粒拷贝数指的是质粒载体在宿主菌中的数量，往往根据质粒载体自身的复制子决定(ori)。Ori具有许多种，不同的ori使得相应的载体具备不同的拷贝数。不同拷贝数的质粒具有不同的应用场景。高拷贝数的ori如pMB1、pUC、RSF1030等在细胞中具有100
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1000个拷贝，往往用于大量DNA片段的制备、高效的非毒性蛋白表达等；中拷贝数的ori如ColE1、pBR322、P15A、CloDF13、ColA、R6K等在细胞中具有15
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50个拷贝，经常用于微毒性蛋白和基因的表达；低拷贝数的ori如pSC101、RK2、F1、P1等在细胞中只具有1
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5个拷贝，通常用于高毒性蛋白和基因的表达，来减少毒性蛋白或基因对宿主细胞的影响，如Cas蛋白、DNA损伤蛋白、转座酶、蛋白酶K等。但是，在基因编辑或者基因诱变时，低拷贝质粒经常存在表达能力弱而影响质粒上基因的功能，特别是在基因诱变质粒上，低效的诱变质粒会影响进化的速度。但高拷贝诱变质粒会在进化前就对进化宿主菌造成严重的背景突变，影响进化的质量，因此，开发一种可控质粒拷贝数的方法，在进化过程中，是十分重要的。
[0003]定向进化是近些年来兴起的生物技术，利用实验室规模的进化系统，可以在数月的时间内获得自然界中需要数十亿年的进化结果，是一项使用的蛋白或RNA改造技术。噬菌体辅助菌株进化技术，又称为PACE技术(phage assisted continuous evolution)，是哈佛大学David R.Liu于2011年开发的一种基于噬菌体的酶进化技术。这种技术的核心是将酶的活性与噬菌体的侵染能力进行偶联，即酶的活性越强，噬菌体的效价越高。再利用随机诱变的方法在进化过程不断的产生酶突变体，酶的基因整合到了噬菌体的基因组中，从而实现基因组上携带越高活性酶基因能够包装出更高活性噬菌体的目的。最终利用此方法筛选出高活性的酶变体。PACE具有操作简单、成本低廉和进化速度快等优点，因此广泛应用在各种酶进化的领域。但是，PACE使用的基因诱变技术是高拷贝的质粒，这很大程度上造成了背景突变，影响PACE的操作和使用可行性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种可控拷贝数的质粒，其表达量受受到外加诱导物或者外加压力的影响。
[0005]本专利技术采用的技术方案为：一种可控拷贝数的质粒，所述质粒包含ColE1复制子，且在ColE1复制子的RNA
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II启动子下游插入操纵子，所述操纵子为乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、四环素操纵子或cumate操纵子。
[0006]优选的，ColE1复制子的序列如SEQ ID NO:1
‑
4中任一项所示。
[0007]本专利技术还公开了一种可控拷贝数的表达体系，包括上述的质粒，以及大肠杆菌宿主菌，所述质粒转化到大肠杆菌宿主菌中。
[0008]本专利技术还公开了一种可控拷贝数的突变质粒，所述突变质粒表达造成DNA损伤和低保真修复的酶，所述突变质粒包含ColE1复制子，且在ColE1复制子的启动子下游插入cumate操纵子。
[0009]优选的，所述造成DNA损伤和低保真修复的酶为低保真DNA聚合酶、DNA脱氨酶、DNA甲基化酶、DNA去甲基化酶、DNA糖基化酶、DNA编辑酶或DNA修复抑制酶。
[0010]优选的，所述酶的基因启动子使用噬菌体诱导启动子。
[0011]优选的，所述突变质粒的序列如SEQ ID NO:5所示。
[0012]本专利技术还公开了上述的突变质粒在噬菌体辅助进化中的应用。
[0013]本专利技术还公开了一种可控质粒拷贝数的噬菌体辅助进化体系，包括一宿主菌、一突变质粒、一gIII基因表达辅助质粒和一缺少gIII基因的M13噬菌体基因组，所述突变质粒为上述的突变质粒。
[0014]优选的，所述宿主菌是含F质粒的大肠杆菌。
[0015]本专利技术公开了一种可控质粒拷贝数方法，该方法是在ColE1复制子的基础上，加入乳糖操纵子、四环素操纵子或者阿拉伯糖操纵子，使得质粒的拷贝数受到诱导物的控制。此外，本专利技术利用噬菌体诱导启动子来调控ColE1复制子的表达，使得质粒的拷贝数在噬菌体未侵染时处于低拷贝的水平，在噬菌体侵染后拷贝数显著增加到高拷贝水平。在噬菌体辅助进化进程中，利用噬菌体诱导启动子来控制突变质粒的拷贝数，同时利用噬菌体诱导启动子来诱导突变基因的表达，从而获得具有更高活性的造成DNA损伤和低保真修复的酶。这种方式在进化过程中既可以保证未受到噬菌体侵染的宿主菌中突变质粒的拷贝数较低和突变基因的表达受到抑制，防止无意义的背景突变，又可以在噬菌体侵染宿主菌后扩大了突变质粒的拷贝数和开启突变基因的表达，有效提高噬菌体基因组的进化效率。
附图说明
[0016]图1为IPTG诱导质粒PUC19
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ColE1
‑
LacO拷贝数变化。
[0017]图2为四环素诱导质粒PUC19
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ColE1
‑
tetO拷贝数变化。
[0018]图3为cumate诱导质粒PUC19
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ColE1
‑
cuO拷贝数变化。
[0019]图4为噬菌体诱导质粒PUC19
‑
ColE1
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PSPO拷贝数变化。
[0020]图5为噬菌体诱导扩增的突变质粒示意图。
[0021]图6为噬菌体侵染前后突变质粒变化。
[0022]图7为噬菌体侵染前后宿主基因组和噬菌体基因组突变率。
[0023]图8为突变偏好性对比。
具体实施方式
[0024]以下结合附图，通过实施例进一步说明本专利技术，但不作为对本专利技术的限制。以下提供了本专利技术实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本专利技术，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]实施例1可控CloE1复制起始位点的测试。
[0026]ColE1复制子的强度受到其自身的两个非编码RNA调控，分别为RNA
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positive(RNA
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II)和RNA
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negative(RNA
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I)。RNA
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II的表达可以提高ColE1复制子的质粒拷贝数，而RNA
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I通过抑制RNA
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II的活性来抑制质粒的拷贝数。两个RNA由各自的启动子介本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可控拷贝数的质粒，其特征在于所述质粒包含ColE1复制子，且在ColE1复制子的RNA
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II启动子下游插入操纵子，所述操纵子为乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、四环素操纵子或cumate操纵子。2.根据权利要求1所述的可控拷贝数的质粒，其特征在于ColE1复制子的序列如SEQ IDNO:1
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4中任一项所示。3.一种可控拷贝数的表达体系，其特征在于包括权利要求1或2所述的质粒，以及大肠杆菌宿主菌，所述质粒转化到大肠杆菌宿主菌中。4.一种可控拷贝数的突变质粒，所述突变质粒表达造成DNA损伤和低保真修复的酶，其特征在于所述突变质粒包含ColE1复制子，且在ColE1复制子的启动子下游插入cumate操纵子。5.根据权利要求4所述的突变质粒，其特征在于所述造成DNA损伤和低保真修复的酶为低保...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志乾，刘丽花，陈西朋，江翱，吴奕瑞，吴嵩，何茜，赖诗静，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：