一种2-吡咯烷酮生物传感器的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种2

【技术实现步骤摘要】
一种2
‑
吡咯烷酮生物传感器的构建及应用


[0001]本专利技术涉及提供一种2
‑
吡咯烷酮生物传感器的构建及应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]生物传感器(biosensor)是以生物学组件作为主要功能元件，能够感应特定的待测物质，并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。生物传感功能元件中的启动子是决定转录起始、影响转录速率的一段关键DNA序列，启动子强度直接影响报告基因的转录水平。
[0003]荧光基因(绿色荧光蛋白gfp、红色荧光蛋白mCherry等)是目前应用最为广泛的一类报告基因，在特定的激发光下可以快速准确测量荧光强度，结合荧光激活细胞分选技术更是能够实现目的菌株的高通量筛选。构建基于荧光检测的生物传感器，将2
‑
吡咯烷酮浓度与荧光强度偶联，有望用于2
‑
吡咯烷酮合成酶的高通量筛选。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种响应2
‑
吡咯烷酮的生物传感器，含有启动子Pcon、ChnR编码基因，启动子Pb
‑
E1和荧光蛋白编码基因；所述启动子Pb
‑
E1上具有转录因子结合位点，所述启动子Pb
‑
E1调控荧光蛋白编码基因的表达；所述启动子Pcon调控ChnR基因的表达；所述启动子Pcon和启动子Pb
‑
E1的转录方向相反。
[0005]在一种实施方式中，所述启动子Pcon、ChnR编码基因、启动子Pb
‑
E1和荧光蛋白编码基因位于同一质粒或同一基因组DNA上。
[0006]在一种实施方式中，所述转录因子结合位点具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
[0007]在一种实施方式中，所述荧光蛋白编码基因包括但不限于mCherry。
[0008]在一种实施方式中，所述启动子Pcon的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ChnR编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述启动子Pb
‑
E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述荧光蛋白编码基因mCherry的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]在一种实施方式中，所述生物传感器以pBbS5C
‑
RFP质粒为质粒骨架。
[0010]本专利技术还提供了含有所述生物传感器的重组微生物细胞。
[0011]在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0012]在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BW25113。
[0013]本专利技术还提供了所述生物传感器在筛选2
‑
吡咯烷酮高产菌株、高活力的2
‑
吡咯烷酮合成关键性酶等方面的应用。
[0014]在一种实施方式中，所述筛选2
‑
吡咯烷酮高产菌株是将所述生物传感器转入目的菌株细胞内，将待筛选的菌株在一定条件下培养一段时间，根据菌株发酵液的荧光强度筛选2
‑
吡咯烷酮高产菌株。
[0015]本专利技术还提供了一种新的启动子，含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0016]有益效果：
[0017]本专利技术提供一种2
‑
吡咯烷酮的生物传感器，在原有基础上对其启动子区域中调控蛋白的结合位点突变，增强了该传感器对高浓度的2
‑
吡咯烷酮的信号响应，可更好用于对2
‑
吡咯烷酮合成相关酶和菌的定向进化。本专利技术对启动子的改造不是单纯的提高基因的转录水平，是通过改造后的生物传感器在不同浓度的2
‑
吡咯烷酮条件下荧光强度的差异性更大，以更好的区分开提高2
‑
吡咯烷酮产量的菌株或酶，减少假阳性的筛选。
附图说明
[0018]图1为响应2
‑
吡咯烷酮的生物传感器示意图。
[0019]图2为对启动子进行优化后的生物传感器在添加不同浓度2
‑
吡咯烷酮后的荧光强度变化。
[0020]图3为生物传感器在流式细胞仪(FACS)分选测试。
具体实施方式
[0021]培养基：
[0022]LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH调节该培养基的pH达到7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min。
[0023]M9培养基：M9 salts(5X)200mL，20％葡萄糖20mL，1M MgSO
4 2mL，1M CaCl20.1mL，H2O 780mL。其中M9 Salts(5X)：Na2HPO
4 33.9g/L，KH2
P
O
4 15g/L，NaCl 2.5g/L，NH4Cl 5g/L，用1000mL去离子水重悬上述粉末，加热搅动使其完全溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min；20％葡萄糖溶液过滤除菌，4℃保存；1M MgSO4溶液和1M CaCl2分别121℃灭菌。
[0024]实施例1生物传感器的构建及启动子优化
[0025]图1为2
‑
吡咯烷酮诱导的生物传感器系统，以pBbS5C
‑
RFP质粒为骨架，含有启动子Pcon、ChnR编码基因，启动子Pb
‑
E1和荧光蛋白编码基因mCherry；所述启动子Pcon的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ChnR编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述启动子Pb
‑
E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述荧光蛋白编码基因mCherry的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述启动子Pb
‑
E1上具有转录因子结合位点，所述启动子Pb
‑
E1调控荧光蛋白编码基因mCherry的表达；所述启动子Pcon调控ChnR基因的表达；所述启动子Pcon和启动子Pb
‑
E1的转录方向相反。
[0026]本专利技术构建的生物传感器的工作原理为：在环境中含有2
‑
吡咯烷酮的情况下，受Pcon启动子调控表达的转录因子ChnR结合环境中的2
‑
吡咯烷酮诱发DNA结合域的构象变化，并结合在位于启动子Pb
‑
E1上的转录因子结合位点TGTAGCCCACC，激活转录，从而调控启动子Pb
‑
E1表达荧光蛋白。2
‑
吡咯烷酮浓度越高，Pb
‑
E1调控转录的强度越强，从而荧光信号越强。
[0027]在质粒pBbSLactamC
‑
mCherry(公开于论文《Development of a Transcription Factor
‑
Based Lactam Biosensor》)的基础上，对启动子中的动子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种响应2
‑
吡咯烷酮的生物传感器，其特征在于，含有启动子Pcon、ChnR编码基因、启动子Pb
‑
E1和荧光蛋白编码基因；所述启动子Pb
‑
E1上具有转录因子结合位点，所述启动子Pb
‑
E1调控荧光蛋白编码基因的表达；所述启动子Pcon调控ChnR基因的表达；所述启动子Pcon和启动子Pb
‑
E1的转录的方向相反；所述转录因子结合位点具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述启动子Pcon、ChnR编码基因、启动子Pb
‑
E1和荧光蛋白编码基因位于同一质粒或同一基因组DNA上。3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光蛋白编码基因包括但不限于mCherry。4.根据权利要求1～3任一所述的生物传感器，其特征在于，所述启动子Pcon的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭莺祺，林恒佳，杨洋，郭卉，陈升宝，
申请(专利权)人：潍坊亚森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：