本发明专利技术属于生物技术领域,公开了一种构建融合质粒的方法，由该方法构建的融合质粒和用途。本发明专利技术方法利用丝氨酸整合酶催化多质粒融合，在融合体系中，对供体基因、受体基因和丝氨酸整合酶进行孵育，获得所述融合基因。该方法利用丝氨酸整合酶即可实现多种不同质粒的融合，相较于其他分子克隆技术，具有产物得率高，操作过程简单，成本低等优点，同时可以实现环状DNA分子之间的融合以及可堆叠的多轮质粒融合，可以成为一种构建融合质粒的新手段。可以成为一种构建融合质粒的新手段。可以成为一种构建融合质粒的新手段。
【技术实现步骤摘要】
一种构建融合质粒的方法、融合质粒和用途
[0001]本专利技术涉及一种构建融合质粒的方法，具体涉及体外利用丝氨酸整合酶催化多质粒融合的简便方法，属于生物
技术介绍
[0002]分子克隆是基因工程领域中最重要的技术之一，旨在将所需要研究的目的基因片段插入到质粒载体上。目前常用的分子克隆手段主要包括“Restriction Enzyme Digestion and Ligation”、“TOPO Cloning”、“Golden Gate Assembly”、“Gateway Cloning”、“Gibson Assembly”等，这些方法都需要通过酶切质粒或者PCR方式预先准备线性化DNA片段作为插入片段和质粒载体，实验操作繁琐；且所得的分子克隆产物需要进一步测序验证，整个过程的时间与成本花费较高。目前尚缺乏精确、高效的环状DNA融合技术。
[0003]随着合成生物学的发展，重组酶被广泛运用于基因组编辑、基因线路设计和线性DNA片段组装等领域。如丝氨酸整合酶——重组酶家族中的一个分支，通常来源于各类细菌的噬菌体基因组中。它们能够特异性识别分别位于噬菌体基因组上attP(attachment site by phage)以及细菌的基因组上attB(attachment site by bacteria)，长约50bp的双链DNA序列；当丝氨酸整合酶与attP、attB序列识别时，其会自发形成四聚体，并由蛋白质的N端催化两个位点之间发生重组反应；根据attP、attB位点的位置及取向，丝氨酸整合酶可以催化DNA片段间的重组、删除或插入。此外，丝氨酸整合酶发挥催化功能不需要其他的辅酶或辅因子参与，且当不存在特殊辅因子时，其催化反应不可逆。因此，丝氨酸整合酶具有开发成为体外环状质粒融合的潜力。目前尚无开发出相似方法的报道。
技术实现思路
[0004]本专利技术提供一种利用丝氨酸整合酶构建融合质粒的方法，以开发新型分子克隆手段，弥补现有方法的不足。
[0005]本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
[0006]作为本专利技术的第一方面，提供了一种丝氨酸整合酶的表达质粒的构建方法，所述方法包括：
[0007](1)对质粒载体设计引物进行PCR扩增，获得质粒载体的线性化产物；
[0008](2)对丝氨酸整合酶的DNA序列进行密码子优化，以适用于大肠杆菌的蛋白质表达系统；设计引物进行PCR扩增，获得丝氨酸整合酶的线性化产物；
[0009](3)对(1)和(2)中的线性化产物进行同源重组，获得所述丝氨酸整合酶表达质粒。
[0010]作为本专利技术的另一方面，提供了一种丝氨酸整合酶的表达质粒，其包括载体和经密码子优化后的丝氨酸整合酶。在一实施方式中，所述丝氨酸整合酶的表达质粒由如上所述方法构建得到。
[0011]作为本专利技术的另一方面，提供了如上所述的丝氨酸整合酶表达质粒在构建丝氨酸整合酶表达菌株中的用途。
[0012]作为本专利技术的另一方面，提供了一种丝氨酸整合酶表达菌株，所述表达菌株包含如上所述的丝氨酸整合酶表达质粒。
[0013]作为本专利技术的另一方面，提供了一种丝氨酸整合酶的表达方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)培养丝氨酸整合酶表达菌株，获得单克隆；(2)接种到LB培养基中培养，获得种子液；(3)将种子液接种到发酵培养基培养；当OD600＝0.6至0.8时，加入0.5mM异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)，过夜培养，培养获得所述丝氨酸整合酶。
[0014]作为本专利技术的另一方面，提供了一种丝氨酸整合酶，其由如上所述的表达方法获得。
[0015]作为本专利技术的另一方面，提供了丝氨酸整合酶在用于构建融合基因中的应用。
[0016]作为本专利技术的另一方面，提供了一种构建融合基因的方法，在融合体系中，对供体基因、受体基因和丝氨酸整合酶进行孵育，获得所述融合基因。
[0017]作为本专利技术的另一方面，提供了一种构建融合质粒的方法，对供体质粒、受体质粒和丝氨酸整合酶进行孵育，获得所述融合质粒。
[0018]在一实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)配制体外反应体系：向融合体系中加入供体质粒、受体质粒以及适量水，获得体外反应体系；(2)加入如上所述的丝氨酸整合酶；(3)将反应体系置于25℃～37℃孵育；(4)取孵育产物，转化至大肠杆菌化学感受态细胞，依次进行冰上静置，水浴热激，冰上静置，获得所述融合质粒。
[0019]作为本专利技术的另一方面，提供了一种通过如上所述的方法构建得到的融合质粒。
[0020]作为本专利技术的另一方面，提供了一种通过如上所述的融合质粒在开发体外催化多质粒融合技术中的应用。
[0021]作为本专利技术的另一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的融合质粒。相对于现有技术，本专利技术的有益效果在于，本专利技术利用丝氨酸整合酶即可实现多种不同质粒的融合，相较于其他分子克隆技术，具有产物得率高，操作过程简单，成本低等优点，同时可以实现环状DNA分子之间的融合以及可堆叠的多轮质粒融合，可以成为一种构建融合质粒的新手段。
附图说明
[0022]图1所示为三种丝氨酸整合酶表达质粒图谱。
[0023]图2所示为三种丝氨酸整合酶表达菌株经诱导后表达的蛋白，再经SDS
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PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后的结果图。结果显示，在0.5mM IPTG，20℃，250rpm，20h的诱导条件下，三个蛋白均有良好的可溶性。纯化后的蛋白条带清晰且没有其余杂带，纯度高。
[0024]图3左侧所示为一个“受体”质粒以及三个不同“供体”质粒的示意图；右侧所示为为理论上能够构建出的七种不同的融合质粒的示意图(三角符号均代表丝氨酸整合酶的识
别序列)。
[0025]图4所示为进行“供体A”与“受体”质粒融合的流程示意图，其他的质粒融合实验同理。
[0026]图5所示为一种“受体”质粒、三种“供体”质粒以及七种不同的融合质粒，经XbaI单酶切后琼脂糖凝胶电泳示意图。所有DNA条带均与预测的条带结果相对应，即证明所有融合质粒均构建成功；其中，图中右侧数值分别为：受体：2218bps；供体A：3284bps；供体B：3243bps；供体C：3276bps；供体A
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受体:4516+986bps；供体B
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受体:4410+1051bps；供体C
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受体:5341+153bps；供体A
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供体B
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受体:4410+3349+986bps；供体A
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供体C
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受体:5341+2451+986bps；供体B
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供体C
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受体:5341+2345+1051bps；供体A
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供体B
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供体C
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受体：本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.丝氨酸整合酶在用于构建融合基因中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丝氨酸整合酶用于环状基因的融合。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述环状基因为环状DNA，环状RNA；优选为环状质粒。4.一种构建融合基因的方法，其特征在于，在融合体系中，对供体基因、受体基因和丝氨酸整合酶进行孵育，获得所述融合基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下特征中的一项或几项：1)所述融合体系包括缓冲液，螯合剂，抗氧化剂和稳定剂；2)所述丝氨酸整合酶在融合体系中的终浓度为0.1μM～10μM；3)供体基因为环状基因；所述环状基因为环状DNA，环状RNA，优选为环状质粒。4)所述孵育的温度为25℃～37℃；5)所述孵育的时间为1
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4h。6.根据权利要求4所述的构建融合质粒的方法，其特征在于，当构建融合质粒时，对供体质粒、受体质粒和丝氨酸整合酶进行孵育，获得所述融合质粒；所述方法包括如下特征中的一项或几项：a)所述供体质粒包含丝氨酸整合酶识别位点、复制起始位点、抗性基因；所述供体质粒的复制起始位点设置为，在具有受体质粒提供的基因的条件下，才能在细胞中进行复制；b)所述受体质粒包含丝氨酸整合酶识别位点、复制起始位点、抗性基因；c)所述受体质粒具有在细胞中正常复制的起始位点；d)所述供体质粒的复制起始位点为R6K，使得其在pir基因存在时，在大肠杆菌中进行复制；e)所述供体质粒与受体质粒的抗性基因不同；f)15μL融合体系中，所述供体质粒与受体质粒的添加量分别为10～1000ng。7.根据权利要求4～6任一项所述的方法构建得到的融合质粒。8.一种丝氨酸整合酶表达质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供质粒载体的线性化产物；(2)对丝氨酸整合酶的DNA序列进行密码子优化，以适用于大肠杆菌的蛋白质表达系统；设计引物进行PCR扩增，获得丝氨酸整合酶的线性化产物；(3)对(1)和(2)中的线性化产物进行同源重组，获得所述丝氨酸整合酶表达质粒。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下特征中任一项或多项：步骤(1)中，所述质粒载体为pET22b；步骤(1)中，当质粒为pET22b时，引物序列分别如下：正向引物：5
...
【专利技术属性】
技术研发人员：李健，巴方，刘晚秋，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：
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