一种定量检测T7RNA聚合酶酶活性的方法和产品技术

本申请提供了一种定量检测T7RNA聚合酶(T7RNAP)酶活性的方法和产品。所述方法包括：构建包含T7启动子和荧光蛋白的重组表达载体；制备细胞的裂解物；制备与所述重组表达载体和所述细胞的裂解物反应的反应物；然后将所述重组表达载体、所述细胞的裂解物、反应物与包含T7RNA聚合酶的待测样品混合得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测荧光强度的仪器中进行检测，通过一系列操作步骤，检测出荧光值，与标准工作曲线对比，计算出T7RNAP的酶活性。本申请的方法以无细胞催化体系为基础，荧光蛋白为特征表达蛋白，具有准确快速、灵敏度高，安全无放射性，费用经济，操作简便等优点，可直接检测细胞破碎液中的T7RNAP的酶活性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法和产品


[0001]本专利技术属于基因工程与分析检测领域，涉及一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法。具体地，涉及一种以无细胞催化体系为基础，荧光蛋白为特征表达蛋白的检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法。

技术介绍

[0002]T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有原核表达系统中最高的，其由T7启动子和T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)两大元件组成：T7 RNA聚合酶能够特异性识别T7启动子(包括由T7启动子改造的由T7 RNAP特异性识别的启动子)，从而特异性地转录T7启动子后的DNA序列，高效的表达目的蛋白，近年来，随着合成生物学的发展，T7表达系统作为具有正交性的转录元件，在构建逻辑门、真核表达系统、野生型细菌、RNA等研究中有重要的工业价值。然而，T7表达系统目前存在许多问题，不稳定现象的存在是其尤为突出问题，表现为传代3
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5代后，目的蛋白表达量降低甚至不表达，这些问题主要是因为T7 RNAP表达量不合适，过多表达的T7 RNA聚合酶还会导致宿主毒性，从而造成细胞死亡，因此，如何研究该表达系统，定量检测T7 RNA聚合酶的酶活性，特别是在细胞破碎液中直接检测T7 RNAP酶活性是指导和研究T7表达系统应用的关键。
[0003]无细胞催化技术近年来发展迅速，由于在体外进行反应，能够快速合成目标蛋白质，因此也广泛应用于高通量筛选、特异性检测、代谢通路等研究。基于该技术进行T7 RNAP酶活性检测，相较于传统的放射性同位素标记法、生物素标记法、杂交探针法、RT
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PCR法等，具有灵敏度高，安全无放射性，费用经济，操作简便等优点，更重要的是该方法可以直接检测细胞破碎液中的T7 RNAP酶活性，这是以往的检测方法很难做到的。

技术实现思路

[0004]基于此，针对现有技术中研究T7表达系统时存在的如何能准确快速定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的问题，本申请提供了一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，本申请提供的方法能够直接检测细胞破碎液中的T7 RNAP酶活性。此外，本申请还提供了一种检测T7 RNAP酶活性的制品、组合物和试剂盒，本申请提供的制品、组合物和试剂盒能够准确快速从细胞破碎液中直接检出T7 RNAP酶活性。
[0005]具体来说，本申请涉及以下内容：
[0006]1.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]提供包含T7启动子和信号蛋白的重组表达载体；
[0008]提供细胞的裂解物；
[0009]提供与所述重组表达载体和所述细胞的裂解物反应的反应物；
[0010]将所述重组表达载体、所述细胞的裂解物、反应物与包含T7 RNA聚合酶的待测样品混合得到反应混合物；
[0011]反应完成后，将反应混合物(或定量稀释后的溶液)放入检测信号蛋白所释放的信
号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；
[0012]基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。
[0013]2.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014]提供表达包含T7启动子和信号蛋白的表达载体的细胞的裂解物；
[0015]提供与所述细胞的裂解物反应的反应物；
[0016]将所述细胞的裂解物、反应物加入到包含T7 RNA聚合酶的待测样品中得到反应混合物；
[0017]反应完成后，将反应混合物(或定量稀释后的溶液)放入检测信号蛋白所释放的信号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；
[0018]基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。
[0019]3.根据项1或2所述的方法，其中，所述信号蛋白为荧光蛋白，所述检测信号蛋白所释放的信号的仪器是检测荧光强度的仪器。
[0020]4.根据项1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为基因工程改造的pUC18质粒、pET23a质粒和pBBR1MCS
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3质粒。
[0021]5.根据项1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为原核细胞，优选所述原核细胞为细菌。
[0022]6.根据项1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解包括高压匀浆破碎法、超声破碎法、微球研磨法。
[0023]7.根据项1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应物包含氨基酸，NTPs，缓冲液，能量物质。
[0024]8.根据项1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应在28℃
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40℃进行1min
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24h。
[0025]9.根据项3所述的方法，其特征在于，其还包括基于已知酶活性的标准品绘制其荧光强度的标准曲线。
[0026]10.根据项1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体的大小为2k～6k，优选为3k～3.5k。
[0027]11.根据项1～10中任一项所述的方法，其特征在于，
[0028]在所述重组载体的适当位置以Gibson连接方法插入T7启动子和编码信号蛋白的基因；
[0029]在所述T7启动子和编码信号蛋白的基因的下游插入终止子。
[0030]12.一种定量检测T7 RNA聚合酶的制品，其特征在于，所述制品包括：
[0031]包含T7启动子和信号蛋白的重组表达载体；
[0032]细胞的裂解物；和反应物，优选所述信号蛋白为荧光蛋白。
[0033]13.根据项12所述的制品，其为试剂盒或组合物。
[0034]14.根据项12或13所述的制品，其特征在于，所述制品包括把转入所述重组表达载体的细胞培养后进行裂解获得的表达所述重组表达载体的细胞的裂解物。
[0035]15.根据项12～14中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为基因工程改造的pUC18质粒、pET23a质粒和pBBR1MCS
‑
3质粒。
[0036]16.根据项12～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为原核细胞，优选
所述原核细胞为细菌。
[0037]17.根据项12～16中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应物包含氨基酸，NTPs，缓冲液，能量物质。
[0038]18.根据项12～17中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组载体的大小为2k～6k，优选为3k～3.5k。
[0039]19.根据项12～18中任一项所述的方法，其特征在于，
[0040]在所述重组载体的适当位置以Gibson连接方法插入T7启动子和表达信号蛋白的基因，优选为表达荧光蛋白的基因；
[0041]在所述T7启动子和表达信号蛋白的基因的下游插入终止子。
[0042]有益效果
[0043]本申请的方法的设计思路如下：1.构建不同的表达载体，选择合适的表达载体；2.制备细胞裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供包含T7启动子和信号蛋白的重组表达载体；提供细胞的裂解物；提供与所述重组表达载体和所述细胞的裂解物反应的反应物；将所述重组表达载体、所述细胞的裂解物、反应物与包含T7 RNA聚合酶的待测样品混合得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测信号蛋白所释放的信号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。2.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供表达包含T7启动子和信号蛋白的表达载体的细胞的裂解物；提供与所述细胞的裂解物反应的反应物；将所述细胞的裂解物、反应物加入到包含T7 RNA聚合酶的待测样品中得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测信号蛋白所释放的信号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述信号蛋白为荧光蛋白，所述检测信号蛋白所释放的信号的仪器是检测荧光强度的仪器。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为基因工程改造的pUC18质粒、pET23a质粒和pBBR1MCS
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3质粒。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为原核细胞，优选所述原核细胞为细菌。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解包括高压匀浆破碎法、超声破碎法、微球研磨法。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应物包含氨基酸，NTPs，缓冲液，能量物质。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应在28℃
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40℃进行1min
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【专利技术属性】
技术研发人员：李强，崔明鑫，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：