一种定量检测T7RNA聚合酶酶活性的方法和产品技术

本申请提供了一种定量检测T7RNA聚合酶(T7RNAP)酶活性的方法和产品。所述方法包括：构建包含T7启动子和荧光蛋白的重组表达载体；制备细胞的裂解物；制备与所述重组表达载体和所述细胞的裂解物反应的反应物；然后将所述重组表达载体、所述细胞的裂解物、反应物与包含T7RNA聚合酶的待测样品混合得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测荧光强度的仪器中进行检测，通过一系列操作步骤，检测出荧光值，与标准工作曲线对比，计算出T7RNAP的酶活性。本申请的方法以无细胞催化体系为基础，荧光蛋白为特征表达蛋白，具有准确快速、灵敏度高，安全无放射性，费用经济，操作简便等优点，可直接检测细胞破碎液中的T7RNAP的酶活性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法和产品


[0001]本专利技术属于基因工程与分析检测领域，涉及一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法。具体地，涉及一种以无细胞催化体系为基础，荧光蛋白为特征表达蛋白的检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法。

技术介绍

[0002]T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有原核表达系统中最高的，其由T7启动子和T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)两大元件组成：T7 RNA聚合酶能够特异性识别T7启动子(包括由T7启动子改造的由T7 RNAP特异性识别的启动子)，从而特异性地转录T7启动子后的DNA序列，高效的表达目的蛋白，近年来，随着合成生物学的发展，T7表达系统作为具有正交性的转录元件，在构建逻辑门、真核表达系统、野生型细菌、RNA等研究中有重要的工业价值。然而，T7表达系统目前存在许多问题，不稳定现象的存在是其尤为突出问题，表现为传代3
‑
5代后，目的蛋白表达量降低甚至不表达，这些问题主要是因为T7 RNAP表达量不合适，过多表达的T7 RNA聚合酶还会导致宿主毒性，从而造成细胞死亡，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供包含T7启动子和信号蛋白的重组表达载体；提供细胞的裂解物；提供与所述重组表达载体和所述细胞的裂解物反应的反应物；将所述重组表达载体、所述细胞的裂解物、反应物与包含T7 RNA聚合酶的待测样品混合得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测信号蛋白所释放的信号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。2.一种定量检测T7 RNA聚合酶酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供表达包含T7启动子和信号蛋白的表达载体的细胞的裂解物；提供与所述细胞的裂解物反应的反应物；将所述细胞的裂解物、反应物加入到包含T7 RNA聚合酶的待测样品中得到反应混合物；反应完成后，将反应混合物放入检测信号蛋白所释放的信号的仪器中进行检测，获得信号强度的数据；基于所述信号强度的数据获得T7 RNA聚合酶的酶活性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述信号蛋白为荧光蛋白，所述检测信号蛋白所释放的信号的仪器是检测荧光强度的仪器。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为基因工程改造的pUC18质粒、pET23a质粒和pBBR1MCS
‑
3质粒。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为原核细胞，优选所述原核细胞为细菌。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解包括高压匀浆破碎法、超声破碎法、微球研磨法。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应物包含氨基酸，NTPs，缓冲液，能量物质。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应在28℃
‑
40℃进行1min
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，崔明鑫，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：