一种bFGF热稳定性改造的方法技术

本发明专利技术属于成纤维细胞生长因子的技术领域，公开了一种bFGF热稳定性改造的方法，包括以下步骤：S1.目的基因合成；选取bFGF蛋白，将四个肝素结合位点从K突变为N，得到bFGFK突变体；S2.引物设计和合成；以bFGFK突变体的基因序列为模板，设计引物；在引物的两端分别插入2个酶切点；引物包括上游引物、下游引物；S3.目的基因扩增；以bFGFK突变体的基因序列为DNA模板进行PCR扩增，再经过纯化，备用；S4.重组质粒载体的构建S5.重组bFGFK蛋白的表达及纯化。本发明专利技术通过在特定位点进行氨基酸置换的方法，将bFGF的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)，获得热稳定性提升的bFGFK128/134/138/144N重组蛋白，同时其生物活性没有改变。活性没有改变。活性没有改变。

【技术实现步骤摘要】
一种bFGF热稳定性改造的方法


[0001]本专利技术属于成纤维细胞生长因子的
，具体涉及一种bFGF热稳定性改造的方法。

技术介绍

[0002]成纤维细胞生长因子(FGF)在各种组织中广泛表达，其可与细胞膜上的受体FGFR结合，介导细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、组织损伤修复、血管生成以及代谢调节等多种生理过程。
[0003]碱性成纤维细胞生长因子bFGF(又称FGF2)，是最早被发现的FGF家族成员之一，人类bFGF基因定位于4号染色体。bFGF通过与受体FGFR1
‑
3结合发挥组织发育和修复等多种生物学功能。bFGF可促进干细胞更新增殖，是维持干细胞多能性的重要外源性生长因子，常用做干细胞培养基的重要组分。但是bFGF具有热不稳定性，在37℃时易发生聚集，丧失生物学活性，所以需要在培养基中反复添加bFGF以保证其活性。肝素可介导bFGF与受体结合，三者组成复杂的复合物，增强bFGF的热抵抗力，但是在培养基中添加肝素可能会对细胞产生不利影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的bFGF具有热不稳定性，加入肝素可能对细胞产生不利影响的技术问题，提供一种bFGF热稳定性改造的方法。
[0005]本专利技术通过在特定位点进行氨基酸置换的方法，将bFGF的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)，获得热稳定性提升的bFGFK128/134/138/144N重组蛋白，同时其生物活性没有改变。
[0006]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用以下技术方案，
[0007]一种bFGF热稳定性改造的方法，包括以下步骤：
[0008]S1.目的基因合成
[0009]选取bFGF蛋白，将四个肝素结合位点从K突变为N，得到bFGFK突变体；
[0010]S2.引物设计和合成
[0011]以bFGFK突变体的基因序列为模板，设计引物；在引物的两端分别插入2个酶切点；引物包括上游引物、下游引物；
[0012]S3.目的基因扩增
[0013]以bFGFK突变体的基因序列为DNA模板进行PCR扩增，再经过纯化，备用；
[0014]S4.重组质粒载体的构建
[0015]用Nde I和EcoR I分别对扩增纯化的PCR产物和pET22B质粒进行双酶切，酶切后的bFGFK目的基因与pET22B质粒，用连接酶进行连接，连接产物转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21；
[0016]S5.重组bFGFK蛋白的表达及纯化
[0017]将测序验证正确的pET22B
‑
bFGFK表达载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21，进行亲和层析纯化，得到bFGFK重组蛋白产物；将bFGFK重组蛋白产物做成冻干粉，低温下保存备用。
[0018]优选的，所述bFGF蛋白的序列号：
[0019]MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS。
[0020]其中，bFGF蛋白的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)。
[0021]优选的，所述bFGF蛋白的核酸序列
[0022]ATGGCAGCAGGTTCTATTACTACCCTCCCCGCTCTGCCTGAAGATGGTGGTTCTGGTGCATTTCCCCCGCCTCACTTCAAAGACCCGAAACGTCTGTATTGCAAAAATGGCGGCTTCTTTCTGCGTATCCATCGGATGGCCGTGTAGACGGTGTGCGCGAAAAATCTGACCCCCACATCAAGCTGCAGCTGCAGGCAGAAGAACGTGGTGTGGTGTTATCAAAGGCGTTGTGCAAACCGCTACCTGGCGATGAAAGAAGACGGCCGTCTGCTGGCTTCTAAATGTTTACTGACGAATGCTTCTTCTTCGAACGTCTGGAATCTAACAACTACAACACCTACCGCTCCGTAAGTATACCTCTGGTACGTGGCGCTGAACCGTACCGGTCAGTATAACCTGGGTTCCAACACCGGTCCAGGCCAGAACGCGATCCTGTTCCTCCCGATGTCTGCGAAAAGCGATGATGATGACAAGGCGAATTC。
[0023]优选的，所述bFGFK突变体的蛋白序列为：
[0024]MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVR
[0025]EKSDPHKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFE
[0026]RLESNNYNTYRSRKYTSWYVALNRTGQYNLGSNTGPGQNAILFLPMSAKS。
[0027]优选的，上游引物序列：
[0028]5’‑
GGAATTCCATATGATGGCAGCAGGTTCTATTAC
‑3’
；
[0029]下游引物序列号：
[0030]5’‑
CGGAATTCGAATTCGCCTTGTCATCATCATCGC
‑3’
。
[0031]优选的，PCR反应体系为：2xTaq Mix 25μl，上下游引物各2μl，模板DNA 1μl，ddH2O 20μl；反应程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。
[0032]优选的，T4 DNA连接酶在16℃过夜连接。
[0033]优选的，转化过程为：取10μL连接产物加入装有50μL大肠杆菌感受态细胞DH5α的EP管中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加入500μL LB液体培养基，于37℃、220r/min振荡培养45min复苏；取150μL复苏后的菌液涂布到带氨苄抗性的LB平板，37℃恒温培养箱过夜培养(12～14h)；挑单菌落接种至含终浓度100μg/mL氨苄西林的LB培养基中，37℃、220r/min摇培过夜，抽提质粒，筛选阳性克隆。
[0034]本技术方案与
技术介绍
相比，至少具有如下优点：
[0035]1.本专利技术将bFGF的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)，获得热稳定性提升的bFGFK128/134/138/144N重组蛋白，重组蛋白纯度达到95％以上，可用于蛋白生物活性检测，同时其生物活性没有改变
[0036]2.本专利技术获得的bFGFK128/13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种bFGF热稳定性改造的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.目的基因合成选取bFGF蛋白，将四个肝素结合位点从K突变为N，得到bFGFK突变体；S2.引物设计和合成以bFGFK突变体的基因序列为模板，设计引物；在引物的两端分别插入2个酶切点；引物包括上游引物、下游引物；S3.目的基因扩增以bFGFK突变体的基因序列为DNA模板进行PCR扩增，再经过纯化，备用；S4.重组质粒载体的构建用Nde I和EcoR I分别对扩增纯化的PCR产物和pET22B质粒进行双酶切，酶切后的bFGFK目的基因与pET22B质粒，用连接酶进行连接，连接产物转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21；S5.重组bFGFK蛋白的表达及纯化将测序验证正确的pET22B
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bFGFK表达载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α或BL21，进行亲和层析纯化，得到bFGFK重组蛋白产物；将bFGFK重组蛋白产物做成冻干粉，低温下保存备用。2.根据权利要求1所述的一种bFGF热稳定性改造的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述bFGF蛋白的序列号：MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS；其中，bFGF蛋白的肝素结合位点128、134、138和144位赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)。3.根据权利要求2所述的一种bFGF热稳定性改造的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述bFGF蛋白的核酸序列：ATGGCAGCAGGTTCTATTACTACCCTCCCCGCTCTGCCTGAAGATGGTGGTTCTGGTGCATTTCCCCCGCCTCACTTCAAAGACCCGAAACGTCTGTATTGCAAAAATGGCGGCTTCTTTCTGCGTATCCATCGGATGGCCGTGTAGACGGTGTGCGCGAAAAATCTGACCCCCACATCAAGCTGCAGCTGCAGGCAGAAGAACGTGGTGTGGTGTTATCAAAGGCGTTGTGCAAACCGCTACCTGGCGATGAAAGAAGACGGCCGTCTGCTGGCTTCTAAATGTTTACTGACGAATGCTTCTTCTTCGAACGTCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜学术，林成勇，苏炳灵，赵绍军，
申请(专利权)人：普纳思细胞厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：