一种链格孢霉主要致敏组分重组Alta1的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1的制备方法及应用，其设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因Alt a 1，连入载体pCZN1的NdeI和XbaI位点之间；其次，将获得的重组质粒pCZN1

【技术实现步骤摘要】
一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物分离纯化
，具体涉及一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]链格孢霉是广泛存在于室内外的常年性过敏原，与儿童和青少年过敏性哮喘的发展进程关系密切。据估计，超过80％的哮喘儿童至少对一种室内过敏原过敏，而链格孢霉是其中最主要的过敏原之一。近些年，随着分子诊断技术在过敏性疾病领域的不断发展，越来越多的过敏原主要致敏组分被应用于临床患者的诊疗过程中。因此，对链格孢霉主要致敏组分的获取将具有重要的临床意义。
[0003]目前，链格孢霉的组分蛋白已达17种，而Alt a 1是最主要的致敏蛋白组分。研究证实，Alt a 1在诊断由链格孢霉引起的过敏性疾病患者中具有较高的稳定性和可靠性，＞98％对链格孢霉特异性IgE(specific IgE,sIgE)阳性的患者能检测到Alt a 1
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sIgE的阳性反应。Alt a 1是含157个氨基酸、具有热稳定性、主要存在于链格孢霉孢子中的蛋白组分，其结构呈同源二聚体，非还原状态下，Alt a 1分子量为30kDa，还原状态下可分解为16.4kDa和15.3kDa大小的两种分子。由于大多数有关Alt a 1的纯化实验基本集中在天然Alt a 1(nature Alt a 1,nAlt a 1)的获取，且方法并不完全统一，菌株来源、培养环境、培养基条件和培养时间等多种因素均会导致nAlt a 1产量和质量的异同，因nAlt a 1一般利用天然粗提物提取再进行纯化，而链格孢霉的天然粗提物存在菌株来源、培养环境、培养基条件和培养时间均无统一的标准化流程引起质量参差不齐，所以利用该粗提物纯化得到nAlt a 1也会有质量和纯度上的欠佳；其具有获取难度大、产量小、纯度低和高成本等缺点因此，合成并纯化重组的Alt a 1(recombinant Alt a 1，rAlt a 1)蛋白将具有重要的临床意义和实用价值。一方面，因对链格孢霉免疫治疗的研究甚少导致尚未出现系统的rAlt a 1蛋白合成与纯化方案。另一方面，由链格孢霉引起的过敏性哮喘患者与日俱增，寻求一种比nAlt a 1蛋白更加简易高效的rAlt a 1分离纯化方式将在很大程度上为临床链格孢霉哮喘患者的诊疗提供便利，并减少对国外Alt a 1试剂的依赖，节约临床过敏性疾病患者的就医成本。因此，亟需提供一种rAlt a 1的简单高效地合成与分离纯化的方法。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1蛋白的制备分离纯化方法，该方法比nAlt a 1纯化更加简单高效。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0006]一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1的制备方法，其设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因Alt a 1，其序列如SEQ ID NO.1：
[0007]将该序列连入载体pCZN1的NdeI和XbaI位点之间获得重组质粒pCZN1
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Al t a 1；其次，将获得的重组质粒pCZN1
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Alt a 1转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序；再将pCZN1
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Alt a 1载体导入大肠杆菌中，以IPTG诱导以pCZN1
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Alt a 1为载体的融合蛋白表达。
[0008]本专利技术中经过优化，设计了保护性碱基catatg和catatg，用于提高酶切活性；引物设计做过优化，合成过程中会对Alt a 1序列中的稀有密码子进行优化，最后确定的序列如SEQ ID NO.1所示，因pCZN1载体具有独特的优势，选择其作为优选载体。
[0009]如上所述的制备方法，优选地，所述保护性碱基为catatg和taatctaga。
[0010]如上所述的制备方法，优选地，还包括分离纯化方法，其是将含有pCZN1
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Alt a 1为载体的大肠杆菌大量培养后，将菌体裂解液进行超声，离心、洗涤、溶解后透析，通过镍柱进行亲和纯化并复性，获得高纯度和具有免疫原性的rAlt a 1蛋白。
[0011]如上所述的制备方法，优选地，所述超声的条件为功率：400W，工作4s，间歇8s，共20min。
[0012]如上所述的制备方法，优选地，所述离心的条件为4℃，10000r/min，20min，之后收集沉淀。
[0013]如上所述的制备方法，优选地，洗涤为将沉淀用含浓度为20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M氯化钠，1％ Triton X
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100，pH 8.0的洗涤液进行洗涤2～4次。
[0014]如上所述的制备方法，优选地，所述溶解所用的溶液为20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，透析为在20mM Tris
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HCl，0.15M氯化钠，pH＝8.0的溶液中透析过夜。
[0015]如上所述的制备方法，优选地，镍柱进行亲和纯化所用的结合缓冲液为含20mM咪唑、20mM Tris、0.15M NaCl，pH 8.0的水溶液；
[0016]洗脱液为500mM咪唑、20mM Tris、0.15M NaCl，pH 8.0的水溶液。
[0017]如上述的制备方法获得的重组Alt a 1在制备免疫试剂中应用。获得重组Alt a 1可用于制备抗Alt a 1抗体的免疫直接使用，也可用于制备用于检测Alt a 1抗体的免疫原使用，用于制备检测试剂。
[0018]本专利技术的方法，用大肠杆菌表达系统进行rAlt a 1的重组表达既是本专利技术的创新点，也是本专利技术的关键之处，选用大肠杆菌系统进行表达的在于操作方便、成本低、周期短、表达产量高，且大肠杆菌系统无法对蛋白质进行糖基化修饰，有效的避免了在过敏原组分的表达中，因糖基化引起的检测结果的假阳性问题。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术与传统nAlt a 1蛋白的纯化相比：
[0020](1)本专利技术提供的方法利用原核表达系统和镍柱纯化的方法，极大的简化了rAlt a 1的合成与纯化流程；
[0021](2)通过对纯化得到的rAlt a 1进行考马斯亮蓝染色和嗜碱性粒细胞的活化率的检测，结果表明本专利技术方法纯化得到的rAlt a 1具有高纯度(＞98％)和较好的免疫原性—嗜碱性粒细胞活化率；
[0022](3)该方法获得的rAlt a 1产量高，得率为91％，而nAlt a 1的得率为68.5％，且rAlt a 1生产过程不涉及链格孢霉的粗提物原料，仅需通过诱导融合蛋白表达，极大的节约了nAlt a 1合成过程中所需的链格孢霉原料成本。
[0023]本专利技术获得的rAlt a 1可进一步在小鼠模型上开展该蛋白的免疫治疗研究，将为rAlt a 1在临床患者中的诊疗应用奠定研究基础。
附图说明
[0024本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种链格孢霉主要致敏组分重组Alt a 1的制备方法，其设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基，并合成基因Alt a 1，其序列如SEQ ID NO.1所示，将该基因序列连入载体pCZN1的NdeI和XbaI位点之间，获得重组质粒pCZN1
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Alt a 1；其次，将获得的重组质粒pCZN1
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Alt a1转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序；再将pCZN1
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Alt a 1载体导入大肠杆菌中，以IPTG诱导以pCZN1
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Alt a 1为载体的融合蛋白表达。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护性碱基为catatg和taatctaga。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括分离纯化方法，其是将含有pCZN1
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Alt a 1为载体的大肠杆菌大量培养后，将菌体裂解液进行超声，离心，洗涤，溶解后透析，通过镍柱进行亲和纯化，获得高纯度和具有免疫原性的rAlt a 1蛋白。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘娟，尹佳，李俊达，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：