一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，敲除其生物合成可拉酸的代谢基因wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF，并在gmd基因之前敲入gmd

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌及构建方法


[0001]本专利技术涉及一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌及构建方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，也是目前研究及应用最多的菌株之一。大肠杆菌周身鞭毛，能运动，可用多种碳源发酵产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，其代谢活动能抑制肠道内有害微生物生长，还能合成维生素B、维生素K以及具有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠杆菌遗传背景清晰，基因功能相对明确，同时有着成熟的编辑技术可以对其基因组进行修改；另外，大肠杆菌易于培养，在实验及工业化的发酵过程中对环境的要求相对较低，可以节省大量的生产成本。因此，大肠杆菌在基因表达及生物合成等方面具有较大优势。
[0003]大肠杆菌基因组中具有编码GDP
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葡萄糖
‑6‑
脱氢酶的gmd基因，以及编码GDP岩藻糖合酶的wcaG基因(fcl基因)，两者均在大肠杆菌生物合成中起到重要作用。其中，gmd编码GDP
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葡萄糖
‑6‑
脱氢酶可将GDP
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甘露糖转化为GDP
‑4‑
脱氢
‑6‑
脱氧
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甘露糖；wcaG在基因组位置上紧接gmd，其编码的GDP
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L
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岩藻糖合酶可将GDP
‑4‑
脱氢
‑6‑
脱氧
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甘露糖转化为GDP
‑
L
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岩藻糖，而GDP
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L
‑
岩藻糖是合成HMOs诸多重要物质的中间产物。gmd、wcaG基因位于大肠杆菌可拉酸合成基因簇，用于合成细菌细胞壁组分，也可以用于合成岩藻糖，同时也有研究表明gmd、wcaG基因可用于HMO系列合成。因此，加强gmd、wcaG基因的表达具有重要的意义。
[0004]现有技术中，gmd
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wcaG加强表达的方式大多需要使用质粒，即先将gmd
‑
wcaG基因整合进大肠杆菌的表达质粒，然后通过诱导使目的基因参与合成代谢。但存在如下不足之处：
[0005]1.将gmd
‑
wcaG基因整合到表达质粒上，一方面会增加菌株构建成本，同时也会造成大肠杆菌基因组资源的浪费；
[0006]2.在使用gmd
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wcaG基因的一些合成通路中，需要阻断大肠杆菌合成可拉酸，敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj，但wcaJ上游的wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF的持续表达则会造成大肠杆菌在生物合成中的资源浪费，同时这些基因的代谢物在大肠杆菌胞内连续积累会给细菌造成负担，不利于大肠杆菌生长；
[0007]3.目前使用大肠杆菌基因组表达gmd、wcaG基因，往往难以控制目的基因的表达效率，表达效率太高会导致gmd
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wcaG过量表达，造成细胞资源浪费与生长压力；表达效率过低则会导致产物合成效率低下，底物利用不充分；因此，针对不同的菌株与代谢通路，需要人工控制基因表达强度优化生物合成；
[0008]4.质粒表达往往依赖抗生素维持质粒在大肠杆菌胞内的稳定性，而抗生素的使用一方面会增加培养成本，另一方面则会使合成产物的纯化与质量控制带来额外的步骤。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于解决上述
技术介绍
部分的不足，提供一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌及其构建方法。可充分利用大肠杆菌基因组中gmd
‑
wcaG基因，使其根据不同代谢通路的强度需要进行稳定表达，同时适用不同的大肠杆菌改造，增加了本底菌株的可选项，降低了构建菌株时的成本。
[0010]技术方案
[0011]大肠杆菌基因组中wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF是生物合成可拉酸的代谢基因，在一些生物代谢如2
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FL合成通路中属于不利代谢，因此专利技术人选择将其从基因组中删除以减少不必要的表达；另外由于wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF紧邻于gmd
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wcaG基因上游(5'
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3')，因此专利技术人在敲除wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF的同时敲入gmd
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wcaG基因的表达调控组件，以优化大肠杆菌基因组；gmd
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wcaG基因调节组件之一为启动子，另外，在基因改造后gmd
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wcaG表达不宜过强或过弱，否则会影响细胞生长或底物利用，因此，专利技术人使用不同强度的RBS加以调控。具体方案如下：
[0012]一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌的构建方法：以大肠杆菌为出发菌株，敲除其生物合成可拉酸的代谢基因wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF，并在gmd基因之前敲入gmd
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wcaG基因的表达调控组件，获得高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌；
[0013]所述gmd
‑
wcaG基因的表达调控组件包括启动子和核糖体结合位点。
[0014]所述出发菌株为携带gmd
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wcaG的大肠杆菌，例如，大肠杆菌BL21系列、JM109系列、K12或MG1655，更优选为大肠杆菌JM109(DE3)和BL21(DE3)。
[0015]进一步，所述启动子选自T7、tac、J23119或lacI启动子。
[0016]进一步，所述核糖体结合位点选自BBa_B0034、BBa_B0030、BBa_B0032或BBa_BJ61101，编码序列分别如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4所示。
[0017]采用上述构建方法得到的重组大肠杆菌。
[0018]采用上述构建方法得到的重组大肠杆菌用于发酵生产GDP
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L
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岩藻糖的应用。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020](1)相比于未改造的大肠杆菌，本专利技术构建的菌株gmd
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wcaG基因表达更强，并且由于是基因组改造，相比于现有的质粒优化表达更稳定。
[0021](2)本专利技术用于优化gmd
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wcaG表达的组件可使用诱导型或非诱导型启动子，可以根据不同代谢通路选择使用。使用非诱导型启动子可以使gmd
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wcaG表达过程中不使用诱导剂，减少产物发酵与纯化成本；使用诱导型启动子可以使gmd
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wcaG表达更加可控。
[0022](3)gmd
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wcaG调控组件可使用不同强度的RBS序列，根据gmd
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wcaG在代谢通路中的位置所需的表达强度选择对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除其生物合成可拉酸的代谢基因wcaA,wcaB,wcaC,wcaD,wcaE和wcaF，并在gmd基因之前敲入gmd
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wcaG基因的表达调控组件，获得高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌；所述gmd
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wcaG基因的调节组件包括启动子和核糖体结合位点；所述出发菌株为携带gmd
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wcaG的大肠杆菌。2.如权利要求1所述高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌BL21系列、JM109系列、K12或MG1655。3.如权利要求2所述高效表达gmd、wcaG的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述出发...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，郭涛，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：