一种生产乳糖-N-四糖的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产乳糖

【技术实现步骤摘要】
一种生产乳糖
‑
N
‑
四糖的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种生产乳糖
‑
N
‑
四糖的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]母乳不仅为婴儿提供主要营养，而且还含有保护婴儿免受感染和炎症的重要因素。以乳糖为基础的人乳寡糖(HMOs)是一类典型的因子，在促进婴儿健康方面具有不可替代的作用。HMOs的浓度为5
‑
25g/L，是母乳中的第三主要成分，仅次于乳糖和脂质。迄今为止，已经在人乳中发现了200多种结构不同的HMO，它们构成了人乳和动物乳之间的主要区别。临床研究表明，HMO添加的配方奶粉是安全的，并显示出与母乳喂养婴儿相似的生长模式。迄今为止，至少有7种不同的HMO获得了美国食品和药物管理局(FDA)的公认安全(GRAS)功能强化剂地位，其中6种已被添加到各种品牌的婴儿配方奶粉中。
[0003]乳糖
‑
N
‑
四糖(LNT)由半乳糖、乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖组成，约占总HMOs的6％(w/w)。LNT具有良好的生理作用，包括益生元特性、抗粘附、抗菌活性和抗病毒作用。目前报道的LNT合成方法包括化学合成、酶促合成和微生物生产。化学合成通常伴随着化学废物和副产物的形成，这需要多步反应来保护和去保护官能团。而与酶促合成相比，基于代谢工程的微生物合成不需要昂贵的供体和受体底物，可以通过发酵从简单廉价的材料开始，是大规模生产LNT的有效可行方法。因此，微生物合成LNT的研究越来越多。
[0004]UDP
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖((UDP
‑
GlcNAc)和UDP
‑
半乳糖(UDP
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Gal)是细胞内合成LNT的重要前体。葡萄糖进入细胞后，经由两条途径分别转化为UDP
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GlcNAc和UDP
‑
Gal。(1)UDP
‑
GlcNAc的合成途径：葡萄糖
‑6‑
磷酸(Glc
‑6‑
P)在pgi编码的葡萄糖
‑
6磷酸异构酶的催化下转化为果糖
‑6‑
磷酸(F6P)，F6P依次在glmS编码的谷氨酰胺
‑
果糖
‑6‑
磷酸氨基转移酶、glmM编码的磷酸葡萄糖胺变位酶、glmU编码的N
‑
乙酰氨基葡萄糖
‑1‑
磷酸尿苷转移酶/氨基葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶的催化下转化为UDP
‑
GlcNAc。(2)UDP
‑
Gal的合成途径：Glc
‑6‑
P在pgm编码的葡萄糖磷酸变位酶和galE编码的UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
异构酶的催化下转化为UDP
‑
Gal。
[0005]现有研究中有科学家提出提高LNT产量的策略。比如Liu及McArthur等鉴定了WbgO、Cvβ3GalT为产生LNT的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶；Zhu等人试图从14个推测的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶中筛选新的产生LNT的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶，与WbgO和Cvβ3GalT同源的7种糖基转移酶中，只有Pseudogulbenkiania ferrooxidansβ
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶被筛选为能够产生LNT，且LNT产率高于WbgO和Cvβ3GalT；Li等人将Pseudogulbenkiania ferrooxidansβ
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶作为LNT生成的关键酶，通过uridine 5'
‑
triphosphate(UTP)再生和加强UDP
‑
Gal供应进一步增强了微生物LNT的合成，摇瓶培养和分批补料培养的LNT滴度分别显著提高至6.16g/L和57.5g/L。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供一种生产乳糖
‑
N
‑
四糖的基因工程菌，具有产量高，利于实现工业化生产等优势。
[0008]用于解决问题的方案
[0009]一方面，本专利技术提供一种生产乳糖
‑
N
‑
四糖的基因工程菌，所述基因工程菌表达β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的基因，所述β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的基因来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。
[0010]优选地，所述基因工程菌敲除了β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ和/或UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑2‑
差向异构酶基因wecB和/或葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB。
[0011]优选地，所述基因工程菌表达了β
‑
1,3
‑
乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA。
[0012]进一步优选地，所述β
‑
1,3
‑
乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌。
[0013]优选地，所述基因工程菌还表达了UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE。
[0014]进一步优选地，所述UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE来源于大肠杆菌。
[0015]优选地，所述来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为SEQ ID NO.1。
[0016]优选地，所述来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的核苷酸序列与SEQ ID NO.2相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为SEQ ID NO.2。
[0017]优选地，所述来源于脑膜炎奈瑟球菌的β
‑
1,3
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产乳糖
‑
N
‑
四糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的基因，所述β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的基因来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除了β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ和/或UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑2‑
差向异构酶基因wecB和/或葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了β
‑
1,3
‑
乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA；优选地，所述β
‑
1,3
‑
乙酰葡萄糖胺转移酶基因lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还表达了UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE；优选地，所述UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE来源于大肠杆菌。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的β
‑
1,3
‑
半乳糖基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为SEQ ID NO.1；优选地，所述来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citr...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，化宿南，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：