一种重组卡介苗的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组卡介苗的构建与应用，属于微生物学生物技术领域。本发明专利技术首次确定了敲除结核分枝杆菌分泌蛋白PtpB获得的重组BCG菌株可以促进巨噬细胞的炎症小体信号通路的活化及细胞因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种重组卡介苗的构建与应用


[0001]本专利技术涉及一种重组卡介苗的构建与应用，属于微生物生物


技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的一种古老的传染性疾病，全球约四分之一的人感染Mtb，每年有将近150万人死于结核病。Mtb是感染并寄生于宿主细胞(尤其是巨噬细胞)内的病原细菌，能够通过分泌多种病原蛋白靶向并调控宿主细胞中的一系列免疫调控分子，从而达到逃逸宿主的免疫清除并促进自身长期存活和致病的目的。例如，Mtb的基因组中能够编码两种真核样的酪氨酸磷酸酶(PtpA和PtpB)，它们在Mtb感染巨噬细胞的过程中可被分泌至宿主细胞质中，从而与巨噬细胞内不同的蛋白或脂类相互作用，通过调控宿主各个靶分子的磷酸化水平来达到干扰真核生物信号通路的目的。因此，这些关键的Mtb效应蛋白及其免疫调控机制可能为抗结核新药设计及新型疫苗的开发提供重要的靶点和思路。
[0003]Mtb酪氨酸磷酸酶PtpB由基因ptbB负责编码。在卡介苗(Bacillus Calmette
‑
Gu
é
rin，BCG)基因组中，存在与MtbptpB完全同源(100％)的基因，因此BCG也能够表达和分泌PtpB蛋白。研究表明，PtpB是Mtb的重要毒力蛋白，缺失PtpB的Mtb在小鼠体内的存活能力明显下降。PtpB的磷酸酶活性结构域(P
‑
loop)与真核生物的多种磷酸酶高度相似，其在宿主细胞中不仅具有酪氨酸磷酸酶活性，还具有磷酸肌醇磷酸酶活性，能够靶向调控多种宿主蛋白及磷酸肌醇的磷酸化水平，进而干预和阻断宿主细胞正常的免疫应答功能。
[0004]炎症小体(inflammasome)由胞质中的免疫识别受体(如absent in melanoma 2，AIM2；NOD
‑
like receptor protein 3，NLRP3)、炎性caspase(如caspase
‑
1)及接头蛋白apoptosis
‑
associated speck
‑
like protein containing a CARD(ASC)构成。当感受到病原入侵信号时，炎症小体迅速组装并激活caspase
‑
1，活化的caspase
‑
1一方面能够切割炎性细胞因子前体pro
‑
IL
‑
1β和pro
‑
IL
‑
18产生成熟的IL
‑
1β和IL
‑
18，另一方面能够切割gasdermin D(GSDMD)产生具有活性的N端片段(GSDMD
‑
N)。随后，GSDMD
‑
N结合至细胞膜上的磷酸肌醇，并寡聚形成孔道，从而介导成熟的IL
‑
1β和IL
‑
18释放至细胞外，同时触发细胞焦亡(pyroptosis)。因此，炎症小体信号通路在宿主细胞早期感应病原感染、启动炎性免疫防御反应过程中扮演重要角色。
[0005]BCG是已沿用百年但仍然唯一的TB预防性初种疫苗。BCG主要用于防治儿童结核病，尤其是预防可能致命的结核性脑膜炎和血行播散等重症儿童结核病，而对于成人原发性结核病、肺结核复发尤其是慢性持续性感染患者的预防效果十分有限，不能防止潜伏结核感染者发病，且保护效力逐年减弱(保护时间约10～15年不等)。目前，约有14种候选结核疫苗正在临床开发中。其中，印度的预防型初种疫苗“VPM1002”和我国智飞生物的预防结核潜伏感染发病的“冻干重组疫苗(ACE/BC02)”正处于临床试验阶段。需要指出的是，目前的候选结核新疫苗几乎没有表现出抗原和免疫多样性，因此，有必要开发更有效的重组BCG疫苗。

技术实现思路

[0006]本专利技术构建了敲除了PtpB的重组BCG，解除了PtpB对宿主细胞炎症小体信号通路的抑制作用。炎症小体通路的活化可以增强机体的细胞因子释放和细胞焦亡的发生，从而有利于刺激多种免疫细胞的活化，促进机体的保护性免疫应答，增加抗体等免疫物质的产生，提升生物体的对病原的识别和防御能力。因此，该重组BCG可以作为更高效的BCG重组疫苗开发。本专利技术要解决的技术问题是提供一种重组卡介苗(BCG)，该重组卡介苗是敲除了野生型BCG中编码PtpB蛋白的基因ptbB。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种重组卡介苗，为敲除了编码酪氨酸磷酸酶PtpB基因的卡介苗。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述酪氨酸磷酸酶PtpB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]所述重组卡介苗解除了PtpB对于炎症小体信号通路的抑制，能促进巨噬细胞分泌细胞因子及细胞焦亡，可用作制备BCG疫苗。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供上述重组卡介苗的构建方法，是将卡介苗中编码酪氨酸磷酸酶PtpB的基因ptbB进行敲除。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述敲除的方法包括CRISPR Cas9、同源重组或RNAi。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的包含以下步骤：
[0013](1)将pJV53k质粒电转到BCG感受态中，并涂布在含有卡那霉素的平板上进行筛选；
[0014](2)挑取阳性单克隆，接种于含有卡那霉素抗性的液体培养基中，于35～38℃培养2～3周。随后，收集并制备pJV53k
‑
BCG感受态待用；
[0015](3)获得含有基因ptbB上游基因片段AB和下游基因片段CD的核苷酸序列基因片段AB—Hyg
R
—CD；
[0016](4)将步骤(3)中的基因片段AB—Hyg
R
—CD转化至步骤(2)中的pJV53k
‑
BCG感受态中，涂布于含有潮霉素抗性的平板上筛选阳性克隆；
[0017](5)鉴定并获得敲除酪氨酸磷酸酶PtpB的重组BCG。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的一种实施方式包含以下步骤：
[0019](1)首先将pJV53k质粒通过2.5kV电击转化进入BCG感受态中，该质粒能够在BCG中转录并表达促进外源片段同源重组的酶。随后，将电转化后的BCG涂布在含有卡那霉素的7H10平板上进行筛选；
[0020](2)挑取阳性单克隆菌落，PCR鉴定获得pJV53k
‑
BCG菌株。将鉴定后的阳性菌株接种于含有卡那霉素抗性的7H9培养基中，于37℃培养2～3周。随后，收集并制备pJV53k
‑
BCG感受态待用；
[0021](3)合成编码酪氨酸磷酸酶PtpB的基因ptbB的上游基因片段AB和下游基因片段CD各约500bp的基因序列，分别克隆到pYUB854质粒中，将构建好的质粒再次酶切获得带有潮霉素抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组卡介苗，其特征在于，为敲除了编码酪氨酸磷酸酶PtpB基因的卡介苗。2.根据权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，所述酪氨酸磷酸酶PtpB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.权利要求1或2所述重组卡介苗的构建方法，其特征在于，是将卡介苗中编码酪氨酸磷酸酶PtpB的基因ptbB进行敲除。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述敲除的方法包括CRISPR Cas9、同源重组或RNAi。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包含以下步骤：(1)将pJV53k质粒电转到BCG感受态中，并涂布在含有卡那霉素的平板上进行筛选；(2)挑取阳性单克隆，接种于含有卡那霉素抗性的液体培养基中，于35～38℃培养2～3周；随后，收集并制备pJV53k
‑
BCG感受态待用；(3)获得含有基因ptbB上游基因片段AB和下游基因片段CD的核苷酸序列基因片段AB—Hyg

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，柴琪瑶，汪静，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：