一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
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1,2
‑
岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种α
‑
1,2
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岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和在制备岩藻糖基低聚糖中的用途。

技术介绍

[0002]母乳低聚糖(HMOs)是母乳中除乳糖和脂类物质之外占比最多的组分，HMOs成分复杂，目前已知有200多种成分，在构建新生儿肠道菌群、调节新生儿肠道功能中起着重要作用。但天然的HMOs难以大规模量产，同时现部分国家和地区批准应用于婴幼儿配方食品的组分主要是2
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岩藻糖基乳糖(2
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FL)和乳糖
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N
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新四糖(Lacto
‑
N
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neotetraose)。其中2
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FL的合成研究相对透彻，而生物合成则凭着成本低、工艺简单，安全性高等诸多优势成为主要选择。
[0003]目前为工业化生产2
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FL存在多种开发策略，相较于酶催化或化学酶合成，使用基因工程微生物全细胞合成2
’‑
FL的方式显然是最优的选择。在可能影响2
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FL合成效率的各种因素中，α
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1,2
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岩藻糖基转移酶的催化性能和有效表达对于2
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FL生物合成途径非常关键。2
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FL的从头合成途径或是补救合成途径都必须借由该酶将GDP
‑
L
‑
岩藻糖和乳糖为底物合成2
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FL。寻找在生产菌株中具有足够活性的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶不仅能够有效催化岩藻糖基转移到受体乳糖上，而且有足够高的转化效率维持底物GDP
‑
L
‑
岩藻糖保持在较低浓度，避免GDP
‑
L
‑
岩藻糖对2
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FL前半部分的合成通路形成负反馈抑制。
[0004]α
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1,2
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岩藻糖基转移酶是目前用于2
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FL生物合成的关键酶，2
’‑
FL的从头合成途径或是补救合成途径都必须藉由该酶将GDP
‑
L
‑
岩藻糖以乳糖为底物合成2
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FL。自2006年起首次在大肠杆菌中表达了来源于幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶(FutC)以来便广泛应用于2
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FL的生物合成。后续虽然发现多种α
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1,2
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岩藻糖基转移酶，但结果仍显示FutC对2
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FL和生物合成效率最高。
[0005]由于野生型FutC来源于幽门螺杆菌，其在大肠杆菌中异源表达往往会导致低溶解度蛋白表达和酶活性降低，这对工业化生产2
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FL来说无疑是需要改进的缺点。因此为了增强其在大肠杆菌中的催化效率，需要对现有的蛋白进行改造，进一步提升2
’‑
FL产量。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]以目前已知的2
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FL合成通路中，α
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1,2
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岩藻糖基转移酶的参与是必须步骤，其功能直接影响了最终产物的产量，而现有的改进方法包括增强FutC的表达、密码子优化、寻求不同来源的替代酶都未取得令人满意的效果。例如通过融合伴侣如谷胱甘肽
‑
S
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转移酶(GST)，6xHis标记的前肽序列和硫氧还蛋白肽(Trx)连接在异源岩藻糖基转移酶的N端，以增强在大肠杆菌中的可溶性表达，但由于它们尺寸大，融合伴侣通常也具有固有的特性来干扰靶蛋白的结构和功能；例如在FutC的N
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末端添加三个天冬氨酸分子，简单的氨基酸标签不仅促进其融合伴侣的纯化，而且以较低的代谢负担提高了溶解性，但工程化发酵所得
到的2
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FL滴度仍然不足以工业生产。因此需要对现有的FutC进行蛋白突变筛选，从而提升2
’‑
FL产量。
[0008]用于解决问题的方案
[0009]本专利技术提供一种α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：
[0010](a)与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的野生型α
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1,2
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岩藻糖基转移酶相比，所述突变体包括如下突变位点中的一个或多个：
[0011]T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S；
[0012](b)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列，所述置换是保守置换；和
[0013](c)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
[0014]优选地，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意一个；
[0015]或为T38S和S43N；
[0016]或为T38S、S43N和A79G；
[0017]或为T38S、S43N、A79G和L207I；
[0018]或为T38S、S43N、A79G、L207I和T210C；
[0019]或为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
[0020]或为L207I、T210C和Q239S；
[0021]或为T38S、L207I、T210C和Q239S；
[0022]或为S43N、L207I、T210C和Q239S；
[0023]或为A79G、L207I、T210C和Q239S；
[0024]或为T38S、S43N、L207I、T210C和Q239S；
[0025]或为S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；
[0026]或为T38S、A79G、L207I、T210C和Q239S。
[0027]本专利技术提供一种编码上述突变体的核酸。
[0028]本专利技术提供一种载体，所述载体包含编码上述突变体的核酸。
[0029]本专利技术提供一种包含上述编码α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体的核酸或上述载体的重组工程菌或重组工程细胞。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：(a)与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的野生型α
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1,2
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岩藻糖基转移酶相比，所述突变体包括如下突变位点中的一个或多个：T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S；(b)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、添加或其任意组合的氨基酸序列，所述置换是保守置换；和(c)与(a)中所述的氨基酸序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变位点为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C或Q239S中的任意一个；或为T38S和S43N；或为T38S、S43N和A79G；或为T38S、S43N、A79G和L207I；或为T38S、S43N、A79G、L207I和T210C；或为T38S、S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；或为L207I、T210C和Q239S；或为T38S、L207I、T210C和Q239S；或为S43N、L207I、T210C和Q239S；或为A79G、L207I、T210C和Q239S；或为T38S、S43N、L207I、T210C和Q239S；或为S43N、A79G、L207I、T210C和Q239S；或为T38S、A79G、L207I、T210C和Q239S。3.一种编码权利要求1
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2任一项所述的突变体的核酸。4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的编码α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体的核酸。5.一种包含如权利要求3所述的编码α
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1,2
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岩藻糖基转移酶突变体的核酸或如权利要求4所述的载体的重组工程菌或重组工程细胞。6.一种制备权利要求1或2所述的突变体的方法，其特征在于，包括：培养权利要求5所述的重组工程菌或重组工程细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，郭涛，王亚宁，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：