一种生产N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种生产N

【技术实现步骤摘要】
一种生产N
‑
乙酰神经氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种生产N
‑
乙酰神经氨酸的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]唾液酸是一类9
‑
碳单糖衍生物，广泛分布在自然界生物体内，参与多种生物途径，例如：生长发育、生殖过程、免疫识别等。N
‑
乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是最重要的一种唾液酸，对于婴儿大脑发育、免疫力增强都有重要作用。传统的Neu5Ac获取方式有天然物质提取、酶法合成、微生物发酵等。微生物发酵方法通过对微生物进行一定的基因改造，利用廉价的物质进行发酵从而获得高产量，其中大肠杆菌由于遗传信息清晰、基因编辑便利、培养成本低等原因，被广泛使用。

技术实现思路

[0003]专利技术要解决的问题
[0004]目前微生物发酵方法生产Neu5Ac，通常以大肠杆菌为底盘菌，通过敲除其自身基因NeuAc转运子(nanT)，NeuAc醛缩酶基因(nanA)，N
‑
乙酰甘露糖胺激酶基因(nanK)，N
‑
乙酰甘露糖胺
‑6‑
磷酸2
‑
差向异构酶(nanE)，葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因(nagB)，N
‑
乙酰葡糖胺
‑6‑
磷酸乙酰酶基因(nagA)，并且过表达外源乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)，外源N
‑
乙酰葡萄糖胺异构酶基因(neuC)，或者过表达外源N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑2‑
异构酶(AGE)，外源具有高效催化活性的nanA等方式来实现以N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸等为底物进行合成或者以葡萄糖、甘油等为碳源从头合成。以底物进行发酵合成的方法在产量上有一定的突破，但是存在着原材料昂贵、反应条件苛刻等问题。从头合成的发酵方法存在目的产物代谢流不强等问题，导致其产量上不及底物发酵方法，但是原料廉价、发酵更易操作，在工业生产上有更多的应用前景，因此寻找更适宜的合成途径显得十分重要。
[0005]用于解决问题的方案
[0006]一方面，本专利技术提供一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌沉默或敲除了基因组上编码磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM。
[0007]优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码NeuAc醛缩酶基因nanA和/或NeuAc转运子基因nanT和/或N
‑
乙酰甘露糖胺
‑6‑
磷酸2
‑
差向异构酶基因nanE和/或N
‑
乙酰甘露糖胺激酶基因nanK；
[0008]优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码nanA、nanT、nanE和nanK四种基因连在一起构成的一个基因簇nanATEK。
[0009]优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码N
‑
乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE和/或葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB和/或N
‑
乙酰葡糖胺
‑6‑
磷酸乙酰酶基因nagA；
[0010]优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码nagE、nagB和nagA三种
基因连在一起构成的一个基因簇nagEBA。
[0011]优选地，所述重组大肠杆菌导入了NeuAc醛缩酶基因nanA，优选地，所述nanA基因来源于MG1655、Klebsiella quasipneumoniae、Staphylococcus hominis subsp.hominis C80或能表达相同功能酶的微生物；
[0012]优选地，所述编码nanA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。
[0013]优选地，所述重组大肠杆菌导入了N
‑
乙酰葡萄糖胺
‑2‑
异构酶基因AGE，所述AGE基因来源于Anabaena sp.CH1、Synechocystis sp.PCC 6803或能表达相同功能酶的微生物；
[0014]优选地，所述编码AGE基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示。
[0015]优选地，所述重组大肠杆菌导入了葡糖胺
‑6‑
磷酸乙酰转移酶基因GNA1，所述GNA1基因来源于Saccharomyces cerevisiae S288C、Pichia pastoris CBS 7435或能表达相同功能酶的微生物；
[0016]优选地，所述编码GNA1基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示；
[0017]优选地，所述编码GNA1基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4所示。
[0018]优选地，所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655和大肠杆菌JM109；优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0019]一方面，本专利技术提供一种生产N
‑
乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1
‑
7任一项所述重组大肠杆菌为发酵菌株，在30
‑
37℃发酵培养至少24h。
[0020]优选地，所述方法利用葡萄糖或甘油作为碳源进行发酵。
[0021]一方面，本专利技术提供上述重组大肠杆菌在医药、食品和化工领域中的应用；
[0022]优选地，上述重组大肠杆菌在生产含有N
‑
乙酰神经氨酸的产品中的应用。
[0023]专利技术的效果
[0024]本专利技术在已有工程菌基础上，进一步优化葡萄糖到N
‑
乙酰甘露糖胺代谢路径，敲除glmM基因以减少非相关代谢产物产生，最终使用的基因工程菌在发酵实验中，大肠杆菌生产Neu5Ac的能力得到较大幅度的提升，具备发酵工业化应用前景。
附图说明
[0025]图1为N
‑
乙酰神经氨酸合成简易图。
[0026]图2为产物N
‑
乙酰神经氨酸标准品和产物样品液相图。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的
中的技术和科学术语的含义相同。
[0028]一方面，本专利技术提供一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌沉默或敲除了基因组上编码磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM。
[0029]在一些实施方式中，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码NeuAc醛缩酶基因nanA。
[0030]和/或，在一些实施方式中，所述重组大肠杆菌还沉默或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌沉默或敲除了基因组上编码磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码NeuAc醛缩酶基因nanA和/或NeuAc转运子基因nanT和/或N
‑
乙酰甘露糖胺
‑6‑
磷酸2
‑
差向异构酶基因nanE和/或N
‑
乙酰甘露糖胺激酶基因nanK；优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码nanA、nanT、nanE和nanK四种基因连在一起构成的一个基因簇nanATEK。3.根据权利要求1
‑
2任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码N
‑
乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE和/或葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB和/或N
‑
乙酰葡糖胺
‑6‑
磷酸乙酰酶基因nagA；优选地，所述重组大肠杆菌还沉默或敲除了基因组上编码nagE、nagB和nagA三种基因连在一起构成的一个基因簇nagEBA。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌导入了NeuAc醛缩酶基因nanA，优选地，所述nanA基因来源于MG1655、Klebsiella quasipneumoniae、Staphylococcus hominis subsp.hominis C80或能表达相同功能酶的微生物；优选地，所述编码nanA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，应露，倪磊，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：