一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种生物合成羟基酪醇的技术改进，具体为一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用，实现从简单碳源合成羟基酪醇的途径；将携带有质粒pRSFDuet

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种生物合成羟基酪醇的技术改进，具体为一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)，又称3，4
‑
二羟基苯乙醇(3，4
‑
Dihydroxyphenylethanol)，分子量为154.164，分子式为C8H
10
O3，是一种天然多酚类化合物，具有多种生物和药理活性。羟基酪醇具有强效的抗氧作用，能够将其酚羟基的氢转移到活性氧，从而可以保护人类红细胞中过氧化氢对DNA和细胞膜的损伤，也能清除紫外线照射下产生的自由基，保护皮肤光损伤。羟基酪醇还有抗炎活性，可降低炎症相关的基因表达，有抗肿瘤作用，可以通过激活分子信号传导来促进癌细胞的凋亡和抗菌活性，还有抑制微生物活性的作用，对肠道内多种菌株具有抗菌效果。因此，羟基酪醇在化妆品、制药行业和保健食品中具有广泛的应用。目前商业化的羟基酪醇主要从天然植物中提取或通过化学合成获得。自然界中，羟基酪醇大量存在于橄榄叶和果实，可以通过水解橄榄苦苷以及从橄榄油或橄榄油生产过程中的废水中提取得到。
[0003]尽管橄榄相关的原料来源丰富且价格便宜，但从植物提取的方法仍存在以下缺点：操作过程复杂、回收率低、能耗高、强酸性以及耗时较久。羟基酪醇也可以通过化学方法合成，但该方法底物成本较高、工艺复杂、条件严苛、污染环境以及存在溶剂残留等问题，难以批量生产。因此，利用廉价原料通过生物合成的方式高效生产高附加值的羟基酪醇，有利于促进羟基酪醇的工业化发展。
[0004]生物合成羟基酪醇的研究有：Santos等人利用乳酸菌降解橄榄苦苷合成羟基酪醇，在有氧和无氧条件下测试了六株细菌对橄榄苦苷的降解效率，结果发现最有效的菌株是植物乳杆菌6907，对橄榄苦苷的降解率能达到90％，但橄榄苦苷转化成羟基酪醇的转化率仅有30％；Allouche等利用黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌通过酪醇异构体合成羟基酪醇，以海藻酸钙水凝胶为载体，应用微生物固相负载技术，将黏质沙雷氏菌和铜绿假单胞菌固载上去，然后经过固载的两种细胞催化酪醇生成羟基酪醇，结果显示该载体能够以4g/L酪醇溶液为底物生成羟基酪醇，产物转化率达到82％；Brooks等利用表达酪氨酸酶活性的恶臭假单胞菌催化酪醇合成羟基酪醇，其产率达到77％；Bouallagui等利用微生物固相负载技术将海藻酸钙珠中铜绿假单胞菌静息细胞固载在海藻酸钙水凝胶上，能以5g/L酪醇为底物生成羟基酪醇，产物转化率达到86％。以上生物合成羟基酪醇的研究中都以酪醇为底物，其成本较高，难以大量生产。Satoh等人研究了以L
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酪氨酸为底物生物合成羟基酪醇的途径，酪氨酸在辅因子四氢褐变蛋白的参与下经过小鼠来源的酪氨酸羟化酶羟化，但是四氢褐变蛋白目前还无法通过商业渠道获得，因此严重限制了该途径中关键酶的生物催化效率，还研究了以葡萄糖为原料生成羟基酪醇，最终获得的羟基酪醇含量为12.3mg/L。Li等人以L
‑
酪氨酸为底物合成中间产物酪醇，然后再进一步合成羟基酪醇，得率接近50％。Chen等人研究了以酪氨酸为底物的两种混合途径生产羟基酪醇，当两个途径同时与每个单独的途
径相比起作用时，合成能力显著提高，通过分批补料发酵获得最终的羟基酪醇产量为1.89g/L。
[0005]所以综上所述可以看出，目前现有技术中生物合成羟基酪醇的方法是可行的，但是就如何实现生物合成方式下高产羟基酪醇仍是一个有待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法及应用，实现从简单碳源合成羟基酪醇的途径。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤，步骤一、PCR扩增获取HpaBC、LAAD基因和线性化pRSFDuet
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1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD；PCR扩增获取ARO10、ADH基因和pRSFDuet
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HpaBC
‑
LAAD载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD
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ARO10
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ADH；PCR扩增获取AROG、TYRA基因和线性化pETDuet
‑
1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pETDuet
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AROG
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TYRA；
[0008]步骤二、将质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD
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ARO10
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ADH和质粒pETDuet
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AROG
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TYRA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌BLAH，以及将质粒pRSFDuet
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1和pETDuet
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1共同转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌BLCK。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的应用，将权利要求1中重组大肠杆菌应用于发酵生产羟基酪醇。
[0010]作为优选，通过重组大肠杆菌表达6种酶：羟化酶、L
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α
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氨基酸脱氨酶、α
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酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、2
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脱氢
‑3‑
脱氧磷酸庚酯醛缩酶和分支酸突变酶/苯甲酸酯脱氢酶。
[0011]作为优选，所述重组大肠杆菌生产方法，包括如下步骤，
[0012]步骤一、将携带有质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD
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ARO10
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ADH和质粒pETDuet
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AROG
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TYRA的重组大肠杆菌BLAH和携带有质粒pRSFDuet
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1和pETDuet
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1的重组大肠杆菌BLCK于LB培养基中培养；
[0013]步骤二、按0.5～2％的接种量接入TB培养液中扩大培养，然后加入0.1～0.3mM的诱导剂进行诱导培养，以及在30℃，220r/min下继续培养进行产物的积累，每隔8小时液相色谱检测羟基酪醇产量。
[0014]本专利技术有益效果：本专利技术的采用大肠杆菌作为发酵生产羟基酪醇的发酵菌，作为最简单的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养且成本低廉；并且对大肠杆菌内源合成酪氨酸途径中的关键基因进行过表达，以及向积累酪氨酸的大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产羟基酪醇重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤一、PCR扩增获取HpaBC、LAAD基因和线性化pRSFDuet
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1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD；PCR扩增获取ARO10、ADH基因和pRSFD uet
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HpaBC
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LAAD载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD
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ARO10
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ADH；PCR扩增获取AROG、TYRA基因和线性化pETDuet
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1载体片段，通过同源重组将这些片段进行融合，得到质粒pETDuet
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AROG
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TYRA；步骤二、将质粒pRSFDuet
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HpaBC
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LAAD
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ARO10
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ADH和质粒pETDuet
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AROG
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TYRA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组大肠杆菌BLAH，以及将质粒pRSFDuet
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1和pETDuet

【专利技术属性】
技术研发人员：罗茂行，吴玉玲，王甜忆，董洪钢，
申请(专利权)人：浙江熙正霖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：