一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，包括以下步骤：S1、按照现有方法提取大肠杆菌SDB2基因组，设计PCR引物，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行PCR扩增；S2、将目标PCR产物与原核表达载体pET28a连接构建出重组质粒pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法。

技术介绍

[0002]复合多酚类物质是植物性饲料资源中广泛存在的一类抗营养因子，可通过与蛋白质、微量元素等形成络合物，降低养分的消化吸收；也可通过其有毒降解产物影响动物健康和种畜禽繁殖性能，降低畜产品品质等，导致其在工业饲料中的用量受限。漆酶(laccase)可以通过降解多酚类物质，改善植物性饲料资源的饲喂价值，提高植物性饲料资源在工业饲料中的用量，从而达到充分利用非常规饲料资源，降低饲料生产成本的目的。漆酶广泛存在于植物、动物、真菌和细菌中，能够催化氧化包括多酚类、芳胺类、羧酸类在内的250多种有机物发生氧化、聚合等反应，目前主要应用于染料脱色解毒、纸浆、纺织品漂白等领域。
[0003]本专利技术人在研究大肠杆菌的过程中，筛选出了一株野生大肠杆菌SDB2(保藏编号为CCTCC M 20221114)，经研究证实，该野生大肠杆菌SDB2能高效分泌漆酶，但因其安全性不明确、专一性差等缺陷，不利于漆酶的工业化生产，因此，对该细菌的漆酶基因进行安全高效的异源表达成为了当务之急。
[0004]近年来，在漆酶异源表达的研究中，相对于热稳定性差、需翻译修饰、生产周期长的真菌漆酶，高稳定性、无需糖基化修饰、生产周期短的细菌漆酶引起研究者的广泛关注。根据大肠杆菌SDB2漆酶基因，构建漆酶异源表达的基因工程菌株是实现漆酶工业化生产的有效途径。大肠杆菌BL21是最早开发的适用于原核蛋白表达的菌株，其表达的外源蛋白具有很高的稳定性，能维持目的蛋白原本的天然结构。本专利技术人筛选的菌株SDB2与BL21同属于大肠杆菌，因此SDB2漆酶基因选用BL21为宿主菌株能精准化实现SDB2漆酶蛋白的异源表达。但是，常规异源表达方式仍然面临产率低、产品质量不稳定等问题，想要实现高效、稳定表达，还需要对其它表达方式进行深入研究。
[0005]中国专利CN114032189A公开了一种降解木质素的融合子菌株R3，该专利技术是利用PEG诱导方法对亲本菌株X1、X19进行融合获得融合子菌株R3，R3通过分泌过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等多种酶类来降解木质素，但该专利技术就单一个体酶对木质素的降解程度没有进行比较，漆酶的作用价值及高效表达没有进行深入研究。
[0006]中国专利CN101736026B公开了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法，该方法在重组大肠杆菌中实现的是麦芽糖结合蛋白
‑
细菌漆酶融合蛋白的高效表达，最终获得的是麦芽糖结合蛋白
‑
细菌漆酶，而非细菌漆酶单体。
[0007]中国专利CN103320453A公开了一种短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用，该漆酶基因来源于短小芽孢杆菌，采用的表达载体为pColdII，构建出的重组大肠杆菌表达漆酶的诱导培养基组成为IPTG(诱导试剂)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，获得的重组漆酶应用于偶氮类和蒽醌类染料脱色，该专利没有对漆酶的高效表达进行深入研究。
[0008]中国专利CN104593312A公开了一株表达枯草芽孢杆菌漆酶的重组大肠杆菌及实
现该菌株分泌表达漆酶的诱导方法，该专利技术创制的诱导培养基组成为IPTG、CuSO4、LB(胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠)，获得的基因工程菌株应用于合成染料中脱色，相应地，该专利也没有对漆酶的高效表达进行深入研究。

技术实现思路

[0009]本专利技术的专利技术目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，本专利技术通过经专利技术人筛选得到的野生大肠杆菌SDB2来获得重组漆酶基因，结合独创的诱导培养方法，能够使该漆酶基因在重组菌中精准化、高效表达，克服了现有技术所存在的不足。
[0010]本专利技术采用的技术方案如下：一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，包括以下步骤：
[0011]S1、按照现有方法提取大肠杆菌SDB2基因组，设计PCR引物，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行PCR扩增，得到目标PCR产物；其中，大肠杆菌SDB2的保藏编号为CCTCC M 20221114；
[0012]S2、回收纯化目标PCR产物，将目标PCR产物与原核表达载体pET28a连接构建出重组质粒pET28a
‑
Lac；
[0013]S3、将重组质粒pET28a
‑
Lac转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，筛选出PCR鉴定为阳性的重组菌株BL21/pET28a
‑
Lac；
[0014]S4、将重组菌株BL21/pET28a
‑
Lac接种到液体培养基中进行培养，得到的菌液再接种至诱导培养基中诱导漆酶基因表达；
[0015]S5、诱导培养结束后离心收集菌体，菌体经悬浮、破碎、离心后得到漆酶蛋白。
[0016]在专利技术中，所述诱导培养基的组成为：0.2～1mM/L的IPTG、1～10mM/L的CuCl2、1～10mM/L的MnSO4、1～10mM/L的FeSO4、1～10mM/L的CaCl2、0.1～2g/L的菜粕汁、0.1～2g/L的白芥子汁、0.1～2g/L的棉籽粕汁。具体用量根据实际需求来调整。
[0017]作为优选，所述诱导培养基的组成为：1mM/L的IPTG、6mM/L的CuCl2、6mM/L的MnSO4、4mM/L的FeSO4、2mM/L的CaCl2的浓度为、1g/L的菜粕汁、1g/L的白芥子汁、1g/L的棉籽粕汁。
[0018]进一步，所述PCR引物包括YfiH
‑
F引物和YfiH
‑
R引物，YfiH
‑
F引物和YfiH
‑
R引物的序列如下：
[0019]YfiH
‑
F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCAAACTGATTGTTCCGCAGTGGCCGCT；
[0020]YfiH
‑
R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCAGC CAAATAAAGCTGGCCATGC。
[0021]进一步，所述目标PCR产物为741bp的漆酶基因，漆酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0022]进一步，所述液体培养基为含有30
±
5μg/ml卡拉霉素的液体培养基。
[0023]进一步，在步骤S1中，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行两轮PCR扩增反应，扩增产物经0.8w％琼脂糖凝胶电泳处理，得到目标PCR产物。
[0024]进一步，在步骤S2中，将纯化后的目标PCR产物经Nde l和Xho l双酶切后，与同样经Nde l和Xho l双酶切的表达载体pET
‑
28a(+)用DNA连接酶进行连接，构建出重组质粒
pET28本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、按照现有方法提取大肠杆菌SDB2基因组，设计PCR引物，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行PCR扩增，得到目标PCR产物；其中，大肠杆菌SDB2的保藏编号为CCTCC M 20221114；S2、回收纯化目标PCR产物，将目标PCR产物与原核表达载体pET28a连接构建出重组质粒pET28a
‑
Lac；S3、将重组质粒pET28a
‑
Lac转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，筛选出PCR鉴定为阳性的重组菌株BL21/pET28a
‑
Lac；S4、将重组菌株BL21/pET28a
‑
Lac接种到液体培养基中进行培养，得到的菌液再接种至诱导培养基中诱导漆酶基因表达；S5、诱导培养结束后离心收集菌体，菌体经悬浮、破碎、离心后得到漆酶蛋白。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述诱导培养基的组成为：0.2～1mM/L的IPTG、1～10mM/L的CuCl2、1～10mM/L的MnSO4、1～10mM/L的FeSO4、1～10mM/L的CaCl2、0.1～2g/L的菜粕汁、0.1～2g/L的白芥子汁、0.1～2g/L的棉籽粕汁。3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，其特征在于，所述PCR引物包括YfiH
‑
F引物和YfiH
‑
R引物，YfiH
‑
F引物和YfiH
‑
R引物的序列如下：YfiH
‑
F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书八页序列表电子公布附图四页，
申请(专利权)人：四川省畜牧科学研究院，
类型：发明
国别省市：