一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶制造技术

本发明专利技术公开了一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶(AFO)及其应用。本发明专利技术通过蛋白质工程技术对野生型黄曲霉毒素氧化酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，筛选得到了一种提高胃蛋白酶抗性的突变体黄曲霉毒素氧化酶。本发明专利技术所述的作用于黄曲霉毒素(AFB1)的突变体黄曲霉毒素氧化酶(AFO

【技术实现步骤摘要】
一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶


[0001]本专利技术涉及黄曲霉毒素氧化酶，特别涉及到提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。

技术介绍

[0002]本课题组1999年在国际上首先报道，从食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)中纯化出具有黄曲霉毒素去毒作用的活性物，命名为黄曲霉毒素解毒酶(AflatoxinDetoxinfizyme，ADTZ)。进一步研究发现，该酶是一种氧化还原酶，可以与黄曲霉毒素(AFB1)等结构类似物发生氧化反应，因此更名为黄曲霉毒素氧化酶(Aflatoxion
‑
Oxidase，AFO)。研究结果显示，AFO能够将AFB1转化成无毒产物。该方法高效、低毒、并且特异性强、不污染环境。
[0003]由于黄曲霉毒素毒性强、热稳定性好，用通常的物理和化学方法不能彻底地去除黄曲霉毒素，并且还会破坏原料营养价值。所以目前最有效的去除黄曲霉毒素的方法是生物酶解法。
[0004]迄今，有关黄曲霉毒素解毒酶的研究主要集中于黄曲霉毒素解毒基因的克隆和异源表达；通过基因重组方法获得产不同特征的黄曲霉毒素解毒酶的菌株；降解机理研究以及黄曲霉毒素解毒酶制剂的制备与应用等。检索中国专利文库，发现有关黄曲霉毒素解毒酶的专利有十余个，关于发现或筛选来自不同微生物来源的具有不同特征的黄曲霉毒素解毒酶及其编码基因的专利有：、CN1712526A等；关于使用基因重组等方法获得不同特性突变体的专利有两个，且均由本课题组申请，其中专利CN104130984A通过对野生型黄曲霉毒素氧化酶底物结合部位的关键氨基酸残基进行改造，专利技术了作用于杂色曲菌素的黄曲霉毒素氧化酶；专利CN104611305A通过对野生型黄曲霉毒素解毒酶三维结构外层部位的关键氨基酸残基进行改造，专利技术了一种对胰蛋白酶抗性提高的突变体；关于黄曲霉毒素解毒酶应用的专利有CN107727722A、CN102175736A、CN101216450A、CN104152419A、CN103947847A、CN1719243A等。检索中国学位论文库有关玉黄曲霉毒素解毒酶的主要研究包括揭示酶学性质、催化反应机理、酶基因的克隆和异源表达、酶的定向改造、解毒酶制剂在饲料工业的应用等。而有关具有胃蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶的研究和专利，迄今尚未见报道。在饲料添加应用中黄曲霉毒素降解酶对胃蛋白酶抗性的延长，可以提高该酶的使用效率，具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的是提供一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。
[0006]本专利技术所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素氧化酶随机突变筛选到的突变体黄曲霉毒素氧化酶，其具有一个氨基酸取代，所述的氨基酸取代是第477位的取代。
[0007]本专利技术是对黄曲霉毒素氧化酶的基因(称为AFO基因)进行易错PCR。由食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)中获得的黄曲霉毒素氧化酶的基因序列的GENBANK登录号为AY941095.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为AAX53114.1(SEQ ID NO.1)。
[0008]本专利技术通过对黄曲霉毒素氧化酶进行突变筛选到了一株突变体黄曲霉毒素氧化酶，经实验表明，所获得的突变体AFO对AFB1的降解功能不受影响，对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型AFO延长了22％，命名为AFO
P477N
。
[0009]根据本专利技术所述的黄曲霉毒素氧化酶的进一步特征，所述在第477位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代脯氨酸；所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0010]本专利技术所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶(AFO
P477N
)，经模拟人工胃液(pH为1.2，浓度为0.012mg/mL的胃蛋白酶在37℃条件下)，使用W
AFO
:W
胃蛋白酶
＝50：1的条件进行反应，经计算后突变体AFO
P477N
的半衰期约39min，而野生型AFO
wt
的半衰期约32min。突变体AFO
P477N
对胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型AFO延长了22％，显示突变体AFO
P477N
对胃蛋白酶的抗性比野生型AFO
wt
提高了。突变体AFO
P477N
的其他酶学性质相比于野生型黄曲霉毒素氧化酶也发生了一些改变。相比于野生型，突变体在20～60℃时仍保有60％以上的活性；最适反应pH为6.0；在pH 7.0～8.0时保有40％以上的活性。
[0011]进一步地，本专利技术提供了一种DNA分子，其编码本专利技术所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶。
[0012]本专利技术所述的突变体DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
[0013]本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DNA分子。
[0014]本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者含有本专利技术所述的载体。
[0015]上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。
[0016]本专利技术还提供了本专利技术所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶的生产方法，包括：在适于黄曲霉毒素氧化酶表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的黄曲霉毒素氧化酶。
[0017]当本专利技术所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主
‑
载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主
‑
载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本专利技术优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。
[0018]本专利技术优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本专利技术优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。
[0019]本专利技术的另一个方面是提供了所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶的用途，具体是所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。
附图说明
[0020]图1是SDS
‑
PAGE蛋白电泳图，黑色箭头所指处为Marker 75Kd条带，黑色方框中为目的蛋白，大小为75Kd左右。其中，泳道1为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清；泳道2为野生型黄曲霉毒素氧化酶蛋白培养上清的硫酸铵沉淀蛋白。
[0021]图2是本专利技术所述的野生型AFO
wt
与突变体AFO
P477N
蛋白在人工胃液处理前和经人工胃液处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于食用性真菌假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素氧化酶随机突变筛选到的突变体黄曲霉毒素氧化酶，其具有一个氨基酸取代，所述的氨基酸取代是第477位的取代。2.根据权利要求1所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化酶，其特征在于：所述在第477位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代脯氨酸；所述的突变体黄曲霉毒素氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的提高胃蛋白酶抗性的黄曲霉毒素氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，钱丹，郭孟颖，刘大岭，谢春芳，刘桂祯，黄炯威，劳伟明，莫世艺，
申请(专利权)人：广东方善能动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：