一种高活性超氧化物歧化酶及其制备方法和在制备抗氧产品中的应用技术

一种高活性超氧化物歧化酶(SOD)及其制备方法和在制备抗氧产品中的应用，涉及生物工程技术领域；包括以下步骤：(1)根据目的SOD酶的氨基酸序列，按照毕赤酵母菌密码子优化，人工合成cDNA；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；(2)将所述cDNA序列克隆至pPICZaA质粒中，构建重组载体；(3)将所述重组载体转入毕赤酵母菌中，培养并诱导表达，得到高活性超氧化物歧化酶。本SOD容易被皮肤及身体吸收利用。既保留了把自由基转化为水和氧气的第一级抗氧化物的高活性，又实现了耐热性强、稳定性高的特点。在化妆品、保健食品等产品中可保证持久、有效清除自由基对机体造成的损害，延缓机体衰老，在制备抗氧产品的领域中具有良好的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性超氧化物歧化酶及其制备方法和在制备抗氧产品中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及表达SOD酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和其在制备美白化妆品中的应用。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可催化超氧阴离子与氢反应，产生氧气和过氧化氢，是一种重要抗氧化剂，其在保护细胞免受氧自由基的毒性方面发挥着关键作用。SOD常以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅助因子的形式存在。几乎所有真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶(Cu
‑
Zn
‑
SOD，SOD1)；几乎所有的线粒体和许多细菌(如大肠杆菌)均含有结合锰的超氧化物歧化酶(Mn
‑
SOD，SOD2)；大肠杆菌和其他一些细菌还含有结合铁的超氧化物歧化酶(Fe
‑
SOD)，也有一些细菌只含Fe
‑
SOD或Mn
‑
SOD。人体中SOD有二类，一是位于细胞质和胞外中结合铜离子和锌离子的SOD1，占总SOD的80％以上，另一类是位于线粒体中结合Mn离子的SOD2，人体内不含原核生物的Fe
‑
SOD及少数原始细菌中所含有的Ni
‑
SOD。Segu
í
J等人在临床上已证明SOD对结肠炎具有较好疗效。在化妆品中，Vozenin
‑
Brotons MC等人提到可用来清除对皮肤造成损害的自由基，减少肌成纤维细胞的表型逆转来减少纤维化。
[0003]胡杨(Populus euphratica)又称胡桐、英雄树、异叶胡杨、异叶杨、水桐、三叶树，是杨柳科杨属胡杨亚属的一种植物，常生长在沙漠中，它耐寒、耐旱、耐盐碱、抗风沙，有很强的生命力。胡杨[CuZn]SOD中包含两段保守His42
–
Pro65和Ser110
‑
Gly154片段，同时胡杨[CuZn]SOD也具有其他[CuZn]SOD同样保守的络合Cu
2+
和Zn
2+
的氨基酸(His
‑
45,His
‑
47,His
‑
62,His
‑
70,His
‑
79,His
‑
119,Asp
‑
82)和两个保守半胱氨酸(Cys
‑
56和Cys
‑
145)。银光委陵菜[CuZn]SOD(PaSOD)第95位含有第3个半胱氨酸(C)，而其他的在该位置是苏氨酸(T)或赖氨酸(K)，Kumar等人把第95位半胱氨酸突变成丙氨酸(C95A)后，研究表明具有更好的耐热性；但是其耐热性程度还是无法满足实际规模化生产的需要。
[0004]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展起来的真核生物基因表达系统之一。该系统可以有效地转录和翻译，准确地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等翻译后加工修饰，能够客观地表达天然蛋白质的结构和功能；可高效表达外源蛋白，具有遗传稳定性。毕赤酵母的醇氧化酶(AOX)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达，可高密度发酵等许多优点，应用十分广泛；故研究将巴斯德毕赤酵母应用于高活性超氧化物歧化酶的表达系统中以高效分泌表达高活性的超氧化物歧化酶具有重大的意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其制备方法简单，易于操作，提高超氧化物歧化酶活性，并具有良好的耐热
性，且生产效率高。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供高活性超氧化物歧化酶，其具有活性高，耐热性强，稳定性高特点。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种高活性超氧化物歧化酶的应用。
[0008]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0009]一种高活性超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)根据目的SOD酶的氨基酸序列，按照毕赤酵母菌密码子优化后，人工合成cDNA；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0011](2)将所述cDNA序列克隆至pPICZaA质粒中，构建重组载体；
[0012](3)将所述重组载体转入毕赤酵母菌中，培养并诱导表达，得到高活性超氧化物歧化酶。
[0013]进一步地，步骤(1)中，目的SOD酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶。
[0014]进一步地，所述SOD酶由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的超氧化物歧化酶定点突变而成。
[0015]进一步地，所述定点突变包括：将所述超氧化物歧化酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。
[0016]进一步地，步骤(3)中，具体操作为：将所述重组载体电转入感受态毕赤酵母菌后，得到重组毕赤酵母菌，培养并诱导表达，得到高活性超氧化物歧化酶。
[0017]进一步地，将重组毕赤酵母菌接入YPD培养基中，在28
‑
30℃、200
‑
300rpm条件下摇床培养至OD
600
＝0.8
‑
1.0，按1:100
‑
300的接种量接入BMGY培养基中，在28
‑
30℃、200
‑
300rpm条件下摇床培养至OD
600
＝2.0
‑
6.0，换成转移到含10.5
‑
1.5％甲醛的BMMY培养基，补加0.5
‑
1.5％甲醇至1％/24小时诱导表达，得到高活性超氧化物歧化酶。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0018]一种高活性超氧化物歧化酶，由所述的高活性超氧化物歧化酶的制备方法所制成。
[0019]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0020]一种高活性超氧化物歧化酶的应用，所述的高活性超氧化物歧化酶在制备抗氧产品中的应用。
[0021]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术的一种高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其制备方法简单，易于操作；按照毕赤酵母菌优化密码子及mRNA高级结构后的人工合成cDNA后，构建得到重组毕赤酵母菌，有效提高超氧化物歧化酶的产率，提高超氧化物歧化酶的活性；超氧化物歧化酶为以超氧化物歧化酶为模板，经多点突变(N9S,N15K,P41L)获得，其耐热性大幅提升，协同重组毕赤酵母菌的表达系统，能高效生产超氧化物歧化酶，提高活性，且超氧化物歧化酶的耐热性强、稳定性高，可长期保藏。
[0023]本专利技术的高活性超氧化物歧化酶，其具有耐热性强，稳定性高，且分子量小，容易被吸收。
[0024]本专利技术的一种高活性超氧化物歧化酶的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)根据目的SOD酶的氨基酸序列，按照毕赤酵母菌密码子优化后，人工合成cDNA；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；(2)将所述cDNA序列克隆至pPICZαA质粒中，构建重组载体；(3)将所述重组载体转入毕赤酵母菌中，培养并诱导表达，得到高活性超氧化物歧化酶。2.如权利要求1所述的高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，目的SOD酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶。3.如权利要求2所述的高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述SOD酶由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的超氧化物歧化酶定点突变而成。4.如权利要求3所述的高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述定点突变包括：将所述超氧化物歧化酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。5.如权利要求1所述的高活性超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，具体操作为：将所述重组载体电转入感受态毕赤酵母菌后，得到重组毕赤酵母菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳，张广献，黄嘉文，
申请(专利权)人：广州美神生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：