通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺及应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，在产量和产率方面具有明显优势，能够大幅降低生产成本，适合大规模工业生产及应用；包含以下步骤：步骤(1)，种子液培养：将保藏的发酵菌株在LB固体培养基进行活化；步骤(2)，发酵罐培养：将二级种子培养液按2％

【技术实现步骤摘要】
通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺及应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺。

技术介绍

[0002]四氢嘧啶(如图1所示)是一种具有两性离子特征的氨基酸衍生物，也是一种相容性溶质，首次在沙漠盐湖的嗜盐菌中被发现，因其具有优异的锁水特性及抗压保护功能，能够维持微生物细胞的渗透压平衡，并帮助对抗极端环境中干旱、高温、严寒、高盐、高辐射等因素对酶、蛋白、核酸、细胞膜和整个细胞的损伤。四氢嘧啶已经被应用于多个领域，如应用于酶制剂工业，提高酶分子的稳定性；作为有效成分应用于咽喉喷雾、鼻腔喷雾、滴眼液、皮肤修护膏，缓解炎症；作为化妆品原料应用于保湿水、防晒喷雾、眼霜、面霜、精华液、护手液等，起到保湿、修复、舒敏、抗衰的作用。
[0003]由于四氢嘧啶的独特分子结构，通过化学合成制备四氢嘧啶的反应步骤长、原料价格昂贵，目前基本采用微生物发酵法获得，包括传统的嗜盐菌发酵工艺及基因工程菌发酵工艺；如公开号为CN112300957A的专利《一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产四氢嘧啶的方法》提出了一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产四氢嘧啶的方法，在5T发酵罐中发酵72h产量达到16g/L，产率达到0.22g/L/h；公开号为CN110699310A的专利《一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用》提出了一种重组谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的方法，在2.5L发酵罐中发酵60h产量达到41.7g/L，产率达到0.70g/L/h。
[0004]综上所述，可以看出针对四氢嘧啶的生产工艺，如何实现高密度发酵，进而提高产量和产率仍然是一个有待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]针对
技术介绍
中提到的问题，本专利技术的目的是提供一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，在产量和产率方面具有明显优势，能够大幅降低生产成本，适合大规模工业生产及应用。
[0006]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，包含以下步骤：
[0007]步骤(1)，种子液培养：将保藏的发酵菌株在LB固体培养基进行活化，将活化好的发酵菌株接入一级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养7
‑
8h，获得一级种子培养液；将一级种子培养液按照1％
‑
2％转接入二级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养15
‑
16h，获得二级种子培养液；
[0008]步骤(2)，发酵罐培养：将二级种子培养液按2％
‑
4％接入发酵罐，首先进入菌体生长阶段，发酵7
‑
8h后，加入诱导剂使发酵进入产物合成阶段，发酵过程中通过控制适当的补料速率维持菌体生长代谢，获得高密度菌体，发酵至60
‑
70h结束；
[0009]步骤(3)，发酵参数监测：发酵过程中定时取样，通过紫外分光光度计测定发酵液
中生物量OD600、通过生物传感仪测定发酵液中葡萄糖含量，通过高效液相色谱仪测定发酵液中产物含量。
[0010]作为优选，步骤(1)中，发酵菌株为引入了四氢嘧啶合成基因簇的重组大肠杆菌BL21；
[0011]作为优选，步骤(1)中，LB固体培养基成分为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，一级种子培养基为LB培养基，所述二级种子培养基为TB培养基。
[0012]作为优选，步骤(2)中，发酵罐培养使用的培养基成分为酵母浸粉7g/L，硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，三水磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁1g/L，一水柠檬酸1.1g/L，盐酸硫胺素0.1g/L，甘油10g/L，葡萄糖10g/L，微量元素液1mL/L；
[0013]作为优选，步骤(2)中，发酵罐培养的初始pH及发酵过程pH为7.0，初始风量为0.6
‑
1vvm，溶氧控制为20％
‑
40％，所述菌体生长阶段的培养温度为37℃，所述产物合成阶段的培养温度为30℃。
[0014]作为优选，步骤(2)中，诱导剂为异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷，其终浓度为0.15
‑
0.25mM。
[0015]作为优选，步骤(2)中，补料使用的培养基成分为七水硫酸镁3g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖600g/L，所述补料速率应使发酵液中的葡萄糖含量不超过1g/L。
[0016]作为优选，步骤(3)中，高效液相色谱条件为色谱柱：C18；流动相：A相：超纯水，B相：纯乙腈；流动相配比：A：B＝95：5；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：紫外检测器，210nm；柱温箱：35℃；
[0017]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的应用，通过该工艺合成的四氢嘧啶成品可应用于化妆品原料、医药原料或其他工业原料的应用。
[0018]综上所述，本专利技术主要具有以下有益效果：
[0019]1.本专利技术使用的发酵菌株为基因工程大肠杆菌，其遗传背景清晰，生长速度快，培养操作简单，无需使用传统嗜盐菌发酵工艺中的高盐培养条件，不会对发酵设备造成腐蚀，工艺适合连续运行；
[0020]2.本专利技术提出的工艺，将发酵分为菌体生长及产物合成两个阶段，通过控制合适的溶氧及补料速率维持菌体生长代谢，获得高密度菌体，发酵58h产量达到89.88g/L，产率达到1.55g/L/h，高于已有发酵工艺水平，且发酵原料以价格低廉的无机盐和葡萄糖为主，能够大幅度降低生产成本，提高生产效率，适合大规模工业生产及应用。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的四氢嘧啶的结构式；
[0022]图2为本专利技术的实施例1发酵过程的生物量及产量曲线；
[0023]图3为本专利技术的实施例2发酵过程的生物量及产量曲线；
[0024]图4为本专利技术的实施例3发酵过程的生物量及产量曲线；
[0025]图5为本专利技术的实施例4的标准曲线。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]本专利技术的通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，包含以下步骤：
[0028]步骤(1)，种子液培养：将保藏的发酵菌株在LB固体培养基进行活化，将活化好的发酵菌株接入一级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养7
‑
8h，获得一级种子培养液；将一级种子培养液按照1％
‑
2％转接入二级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养15
‑
16h，获得二级种子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，其特征在于，包含以下步骤：步骤(1)，种子液培养：将保藏的发酵菌株在LB固体培养基进行活化，将活化好的发酵菌株接入一级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养7
‑
8h，获得一级种子培养液；将一级种子培养液按照1％
‑
2％转接入二级种子培养基，37℃、220rpm振荡培养15
‑
16h，获得二级种子培养液；步骤(2)，发酵罐培养：将二级种子培养液按2％
‑
4％接入发酵罐，首先进入菌体生长阶段，发酵7
‑
8h后，加入诱导剂使发酵进入产物合成阶段，发酵过程中通过控制适当的补料速率维持菌体生长代谢，获得高密度菌体，发酵至60
‑
70h结束；步骤(3)，发酵参数监测：发酵过程中定时取样，通过紫外分光光度计测定发酵液中生物量OD600、通过生物传感仪测定发酵液中葡萄糖含量，通过高效液相色谱仪测定发酵液中产物含量。2.如权利要求1所述的通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(1)中，发酵菌株为引入了四氢嘧啶合成基因簇的重组大肠杆菌BL21。3.如权利要求1所述通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(1)中，LB固体培养基成分为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，一级种子培养基为LB培养基，所述二级种子培养基为TB培养基。4.如权利要求1所述通过基因工程菌高密度发酵合成四氢嘧啶的工艺，其特征在于，步骤(2)中，发酵罐培养使用的培养基成分为酵母浸粉7...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗茂行，王甜忆，吴玉玲，董洪钢，刘迎宾，
申请(专利权)人：浙江熙正霖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：