真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用制造技术

本发明专利技术涉及α

【技术实现步骤摘要】
真菌来源的
α
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L
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鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用


[0001]本专利技术涉及α
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L
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鼠李糖苷酶的应用技术，特别涉及一种真菌来源的α
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L
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鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用。

技术介绍

[0002]α
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L
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鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是能特异性水解鼠李糖苷键的一种水解酶，广泛分布在自然界中的微生物，在细菌(芽孢杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属等)以及真菌(曲霉、木霉、青霉等)中均有α
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L
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鼠李糖苷酶。α
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L
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鼠李糖苷酶可高效水解多种含有α
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鼠李糖苷键的糖苷类物质，例如人参皂苷、柚皮苷、芦丁、橙皮苷以及朝藿定C等。
[0003]α
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L
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鼠李糖苷酶被广泛地应用在食品、医药等领域。食品工业中，α
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L
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鼠李糖苷酶是柚苷酶和橙皮苷酶的主要活性成分，能够有效改善柑橘类果汁风味，去除苦味。且在酿酒工业中能明显提升酿酒过程中香味物质的比例。α
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L
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鼠李糖苷酶的应用极大地提升了软硬饮料的品质。在医疗与保健领域中，由于受到糖苷键的影响许多黄酮类化合物生物利用率比较低，而通过α
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L
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鼠李糖苷酶对黄酮类化合物苷进行水解，增加了黄酮类葡萄糖苷含量，更利于生物活性物质的吸收。
[0004]淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、箭叶淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥茎叶提取物。分子式C33H40015，分子量676.65，CAS号489
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32
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7。
[0005]淫羊藿苷有多种药理作用，并且其水解产物淫羊藿苷元已作为中药一类抗癌新药获批国家临床批件，并进入快速审批程序，并被多位权威专家认为是在中药现代化研究中，继青蒿素之后的又一重大成果。但淫羊藿苷元在淫羊藿属植物体内含量极低，现确实可行的获得方式为通过淫羊藿苷水解获得淫羊藿苷元。然而天然环境中，在淫羊藿草中淫羊藿苷的比例一般在2％以下，相对而言，朝藿定C的含量会比淫羊藿苷更丰富，通常是淫羊藿苷含量的5～6倍。通过水解朝藿定C可以制备淫羊藿苷。可采用生物酶促法催化含量较高的朝藿定C脱去一分子的鼠李糖转化为淫羊藿苷。因此研究淫羊藿苷的大规模工业生产并且环境友好的制备工艺，面对淫羊藿苷元的市场需求，极具现实意义。
[0006]生物催化法制备淫羊藿苷，因其步骤简单，条件温和，环境友好，具有很高的经济价值。生物催化法以淫羊藿苷粗提物为底物，α
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L
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鼠李糖苷酶水解除去朝藿定C的α
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1,2鼠李糖苷键连接的末端鼠李糖，生成产物淫羊藿苷。但利用现有的α
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L
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鼠李糖苷酶酶催化淫羊藿苷粗提物，朝藿定C的转化率还不尽如人意。中国专利文献CN110066760A(申请号CN201910435031.2)公开了，重组AnRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品，于37℃进行催化反应90min可将朝藿定C完全转化为淫羊藿苷，但其转化的浓度与效率离工业化生产还有一定的距离。因此挖掘一种在混合样品中高效催化朝藿定C生成淫羊藿苷的酶，以指导大规模工业化生产淫羊藿苷极具社会价值。

技术实现思路

[0007]针对
技术介绍
中提到的问题，本专利技术的目的是提供一种真菌来源的α
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L
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鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，以解决
技术介绍
中提到的问题。
[0008]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种真菌来源的α
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L
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鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，包括如下步骤：
[0009]步骤一、AmRhaE基因合成及重组表达α
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L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建；
[0010]根据木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因进行密码子优化，以该基因为模板设计用于扩增AmRhaE引物序列对F和R；以上述引物对进行PCR扩增，将PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化，并通过胶回收试剂盒进行回收，得到木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因片段；
[0011]其中，上、下游引物F和R的序列如下:
[0012]F:5
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AGACCATGGAGATGTCCCTGTCCATTGCTA
‑3’
，下划线表示NcoⅠ酶切位点；
[0013]R:5
’‑
GCAGTCGACACCCAGGCTGCTCTCGAAAC
‑3’
，下划线表示SalⅠ酶切位点；
[0014]NcoI和SalI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含50mg/L卡那霉素的LB平板，恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落进行菌落PCR验证；将条带大小正确的菌落接种于LB液体培养基中培养，提取质粒进行序列测定；α
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L
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鼠李糖苷酶AmRhaE的编码基因大小为2589bp，通过序列比对得到测序正确重组质粒pET28a
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AmRhaE；
[0015]步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α
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L鼠李糖苷酶；
[0016]将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a
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AmRhaE；将上述重组菌株于含有50mg/L卡那霉素的LB平板划线培养；单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基中振荡培养；按1％的接种量转接至50mL含有卡那霉素浓度为50mg/mL的LB液体培养基中振荡培养；向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mM，以25℃/30℃/37℃继续振荡培养；
[0017]培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，并收集菌体；用20mL0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，再进行离心，洗涤菌体除去残余培养基；以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20；使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，收集上清，即为α
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L
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鼠李糖苷酶粗酶液；
[0018]步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真菌来源的α
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L
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鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、AmRhaE基因合成及重组表达α
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L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建；根据木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因进行密码子优化，以该基因为模板设计用于扩增AmRhaE引物序列对F和R；以上述引物对进行PCR扩增，将PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化，并通过胶回收试剂盒进行回收，得到木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因片段；其中，上、下游引物F和R的序列如下:F:5
’‑
AGACCATGGAGATGTCCCTGTCCATTGCTA
‑3’
，下划线表示NcoⅠ酶切位点；R:5
’‑
GCAGTCGACACCCAGGCTGCTCTCGAAAC
‑3’
，下划线表示SalⅠ酶切位点；NcoI和SalI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含50mg/L卡那霉素的LB平板，恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落进行菌落PCR验证；将条带大小正确的菌落接种于LB液体培养基中培养，提取质粒进行序列测定；α
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L
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鼠李糖苷酶AmRhaE的编码基因大小为2589bp，通过序列比对得到测序正确重组质粒pET28a
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AmRhaE；步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α
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L鼠李糖苷酶；将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a
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AmRhaE；将上述重组菌株于含有50mg/L卡那霉素的LB平板划线培养；单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基中振荡培养；按1％的接种量转接至50mL含有卡那霉素浓度为50mg/mL的LB液体培养基中振荡培养；向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mM，以25℃/30℃/37℃继续振荡培养；培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，并收集菌体；用20mL0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，再进行离心，洗涤菌体除去残余培养基；以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20；使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，收集上清，即为α
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L
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鼠李糖苷酶粗酶液；步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α
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L鼠李糖苷酶；将α

【专利技术属性】
技术研发人员：田灵芝，董洪钢，
申请(专利权)人：浙江熙正霖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：