粘着箭菌在生物转化3-氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种粘着箭菌在生物转化3

【技术实现步骤摘要】
粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶制备烟酰胺中的应用及其应用方法


[0001]本专利技术属于微生物
，尤其涉及粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶为烟酰胺中的应用及转化方法。

技术介绍

[0002]腈化合物是一类重要的化工合成原料。由腈化合物出发可以获得酰胺、酸等价值更高、应用范围更广的一类化合物。催化腈化合物生成相应的酰胺化合物的酶类为腈水合酶。微生物产生的腈水合酶具有反应条件温和、产率高、副产物少、区域和立体选择性强等优点。目前产生腈水合酶的微生物中，细胞绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis B23，红球菌属Rhodococcus sp.N
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774和玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous J1已成功应用于生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺、3
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氰基吡啶生产烟酰胺，以及己二腈生产5
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氰基戊酰胺。
[0003]烟酰胺，又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物，为白色的结晶性粉末；无臭或几乎无臭，味苦；略有引湿性。在水或乙醇中易溶，在甘油中溶解。临床上主要用于防治糙皮病、口炎、舌炎，病态窦房结综合征，房室传导阻滞等问题。
[0004]目前尚未见有来源于箭菌属(Ensifer)的细菌催化3
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氰基吡啶合成烟酰胺的文献报道。在先前的中国专利(专利号201210277930.2)公开了一株粘着箭菌CGMCC No.6315，及该菌作为一种植物根际促生细菌具有固氮能力的应用，但未公开该菌的其他应用。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种利用粘着箭菌产生的腈水合酶将3
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氰基吡啶生物转化为烟酰胺的应用及其转化方法。
[0006]技术方案：本专利技术的提供了一种粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶制备烟酰胺中的应用。
[0007]进一步地，所述粘着箭菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)，保藏编号:CGMCC No.6315。
[0008]本专利技术还提供了一种粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶制备烟酰胺中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009](1)将粘着箭菌接种于液体培养基中进行恒温发酵培养得到菌液；
[0010](2)将菌液离心后收集细胞再进行洗涤，洗涤后将得到的菌体加入到含有3
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氰基吡啶底物缓冲液中，转化后即得烟酰胺。
[0011]进一步地，所述步骤(1)中的菌液的发酵培养包括：一次发酵培养和二次发酵培养。
[0012]进一步地，所述一次发酵培养和二次发酵培养所用液体培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基的营养液浓度为0.05～1。
[0013]进一步地，所述LB液体培养基中还含有氯化钴，所述氯化钴的浓度为0.05～
0.2mmol/L。
[0014]进一步地，所述一次发酵培养的培养时间为12～24h，所述二次发酵培养的菌液接种量为1％～5％，培养时间为12～48h。
[0015]进一步地，所述步骤(2)中的菌液洗涤包括将收集到的细胞悬浮于磷酸钠盐缓冲液中洗涤，细胞浓度调节为5.0～10.0。
[0016]进一步地，所述3
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氰基吡啶底物缓冲液浓度为200～2000mg/L。
[0017]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本专利技术使用的菌株易于培养，应用于生物催化3
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氰基吡啶合成烟酰胺工艺简单，转化率高且不产生副产物烟酸。产物烟酰胺可作为医药合成中间体，用于临床治疗。
附图说明
[0018]图1为微生物转化3
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氰基吡啶合成烟酰胺示意图；
[0019]图2为本专利技术方法转化合成的烟酰胺及烟酰胺标品对照HPLC图；A为烟酰胺标准品，B为本专利技术方法合成的烟酰胺产物；
[0020]图3为3
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氰基吡啶底物、菌体和本专利技术方法转化合成的烟酰胺产物对照的3D瀑布图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0022]实施例1
[0023]将粘着箭菌CGMCC 6315划线于LB固体琼脂培养基上。
[0024]所用LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH调节至7.0。配制固体培养基时加入20g/L琼脂粉。培养基于115℃高压灭菌30min。
[0025]待固体平板上长出单菌落后，挑取一个单菌落接种至含0.1mmol/L氯化钴的30mL的LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养24h。之后取3mL按1％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养12h。9000rpm离心6min收集细胞，悬浮于0.05mol/L的pH 7.5磷酸钠盐缓冲液中，细胞浓度(OD
600
)调节为5.0。加入到装有浓度为200ppm的2mL 3
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氰基吡啶溶液的离心管。将离心管于30℃、220rpm的摇床中进行反应，2h后取样，再在12000rpm下离心3min，取上清500μL，加入500μL乙腈终止反应。用0.22μm孔径的水相过滤膜过滤后，采用安捷伦1200型高效液相色谱仪检测反应产物。结果如图2所示，粘着箭菌CGMCC 6315可将3
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氰基吡啶(保留时间为8.173min)转化为保留时间为3.521min的产物，该产物的保留时间与标准品烟酰胺一致。
[0026]实施例2
[0027]将粘着箭菌CGMCC 6315划线于LB固体琼脂培养基上。
[0028]所用LB固体琼脂培养基组成同实例一。
[0029]待固体平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取一环经活化的粘着箭菌接种于至含0.1mmol/L氯化钴的30mL的LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养24h。之后取15mL按5％接种量转入含0.1mmol/L氯化钴的300mL的1/15LB液体培养基中，30℃、220rpm振荡培养48h。
[0030]所用1/15LB液体培养基(营养液浓度约为0.07)制备过程：取20mL液体LB培养基，加入280mL双蒸水稀释为300mL的1/15LB培养基。
[0031]再经过9000rpm离心6min后收集细胞，悬浮于0.05mol/L的pH 7.5磷酸钠盐缓冲液中，细胞浓度(OD
600
)调节为5.0。加入到装有浓度为2g/L的2mL 3
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氰基吡啶溶液的离心管。转化2h后取样采用HPLC定量分析测定烟酰胺的含量，在上述条件下，生成的烟酰胺的浓度为652.49mg/L，摩尔转化率为56.4％。
[0032]实施例3
[0033]其他实验条件同实施例2，加入底物浓度为20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶制备烟酰胺中的应用。2.根据权利要求1所述的粘着箭菌在生物转化3
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氰基吡啶制备烟酰胺中的应用，其特征在于，所述粘着箭菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)，保藏编号:CGMCC No.6315。3.一种权利要求1所述的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将粘着箭菌接种于液体培养基中进行恒温发酵培养得到菌液；(2)将菌液离心后收集细胞再进行洗涤，洗涤后将得到的菌体加入到含有3
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氰基吡啶底物缓冲液中，转化后即得烟酰胺。4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的菌液的发酵培养包括：一次发酵培养和二次发酵培养。5.根据权利要求4所述的应用方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈肖玥，陶子菡，吴春美，吴雪娟，吴晨鸿，戴亦军，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：