一种低菌胶团形成能力的细菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种低菌胶团形成能力的细菌的构建方法及其应用，所述低菌胶团形成能力的细菌的构建方法，将鞘氨醇单胞菌基因组中的LuxI基因敲除，得到低菌胶团形成能力的细菌。本发明专利技术的有益效果在于，提供一种低菌胶团形成能力的细菌，能够有效的降低在污水处理过程中功能菌株对膜的堵塞。功能菌株对膜的堵塞。

【技术实现步骤摘要】
一种低菌胶团形成能力的细菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，涉及一种群体感应信号基因敲除菌的构建，以及降低鞘氨醇杆菌菌胶团形成能力的方法。

技术介绍

[0002]为保障居民用水安全，城市污水处理厂通常利用吸附效应、生物降解、消毒杀菌等技术处理污水。微生物来源于环境，利用微生物自身的代谢作用无疑是一种安全、高效、环境友好型的污染治理方法。但菌株等在经历生长、消亡等的生理过程中，极易黏附在管道、滤网等设备中，如不及时清除，极易造成堵塞，严重影响设备的使用寿命、增加成本。传统的清理思路是通过物理、化学等手段清理堵塞，既费时费力又影响效率。研究表明群体感应系统是基于信号分子响应种群密度的细胞间通讯过程，可以有效调控菌落的种群效应。
[0003]鞘氨醇单胞菌是一种革兰氏阴性菌，可以降解多环芳烃、内分泌干扰物等多种环境污染物，其普遍存在LuxI
‑
LuxR型群体感应系统，能够以N
‑
酰基高丝氨酸内酯(AHL)为自诱导剂，由LuxI信号分子合成酶产生，能通过细胞膜自由扩散，并被LuxR型转录调节因子受体特异性识别，进而调控多种基因的表达。
[0004]现有的水处理生物膜存在的缺点如下：活性污泥、水处理微生物改良剂的使用容易造成微生物生物被膜的形成，聚集成菌胶团，堵塞水处理膜，造成成本走高、效率走低。物理方法清理，费时费力，影响生产效率；化学方法也存在引入法学试剂盒盒二次污染的风险，对环境的友好性存在不确定性。而生物法进行自行调控，借助合成生物学手段开发实际应用的环保型菌株，具有效果好、质量稳定、环境友好等特点。

技术实现思路

[0005]针对污水处理厂生物膜的易堵塞问题，区别于传统的堵塞后再清理的思路，专利技术了利用群感缺失株不形成菌胶团的生物学技术，有效降低功能菌株对膜的堵塞。
[0006]本专利技术提供一种低菌胶团形成能力的细菌的构建方法，将鞘氨醇单胞菌基因组中的LuxI基因敲除，得到低菌胶团形成能力的细菌。
[0007]所述鞘氨醇单胞菌为Sphingomonas sp.YK5。
[0008]所述将受体菌基因组中的LuxI基因敲除为如下A1)或者A2)：
[0009]A1)将鞘氨醇单胞菌的基因组中sphI1基因敲除，从而获得低菌胶团形成能力的细菌；所述sphI1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0010]A2)将鞘氨醇单胞菌的基因组中sphI2基因敲除，从而获得低菌胶团形成能力的细菌；所述sphI2的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0011]所述A1)方法中，鞘氨醇单胞菌中的sphI1是通过二次同源重组的方式敲除的，上游同源臂1的序列如序列表中序列3所示，下游同源臂1的序列如序列表中序列4所示。
[0012]所述A1)方法包括向鞘氨醇单胞菌中导入重组载体1进行二次同源重组的步骤，所述重组载体1中含有自5
’
端到3
’
端依次相连的所述上游同源臂1和所述下游同源臂1。
[0013]所述重组载体1为pAK405
‑
sphI1 fusion，所述pAK405
‑
sphI1 fusion为在pAK405质粒中插入上游同源臂1和所述下游同源臂1后得到的重组载体。
[0014]所述A2)方法中，鞘氨醇单胞菌中的sphI2是通过二次同源重组的方式敲除的，上游同源臂2的序列如序列表中序列5所示，下游同源臂2的序列如序列表中序列6所示。
[0015]所述A2)方法包括向鞘氨醇单胞菌中导入重组载体2进行二次同源重组的步骤，所述重组载体2中含有自5
’
端到3
’
端依次相连的所述上游同源臂2和所述下游同源臂2。
[0016]所述重组载体2为pAK405
‑
sphI2 fusion，所述pAK405
‑
sphI2 fusion为在pAK405质粒中插入上游同源臂2和所述下游同源臂2后得到的重组载体。
[0017]上述方法制备得到低菌胶团形成能力的细菌也在本专利技术的保护范围之内。
[0018]上述方法或者低菌胶团形成能力的细菌在如下任一中的应用也应在本专利技术的保护范围之内：
[0019]1)降低细菌形成菌胶团中的应用；
[0020]2)在污水处理中的应用。
[0021]本专利技术还要求保护一种降低细菌形成菌胶团的方法，采用所述的细菌进行发酵培养，从而降低细菌形成菌胶团的几率。
[0022]本专利技术还提供一种成套试剂，所述成套试剂为如下1)或者2)：
[0023]1)所述成套试剂包括引物组合物1，所述引物组合物1由序列7
‑
12所示的序列组成；
[0024]2)所述成套试剂包括引物组合物2，所述引物组合物2由序列13
‑
18所示的序列组成。
[0025]上述引物组合物1或引物组合物2也应在本专利技术的保护范围之内。
[0026]上述引物组合物1或引物组合物2或成套试剂在如下任一中的应用也应在本专利技术的保护范围之内：
[0027]1)降低细菌形成菌胶团中的应用；
[0028]2)在污水处理中的应用。
[0029]本专利技术的有益效果在于，提供一种低菌胶团形成能力的细菌，能够有效的降低在污水处理过程中功能菌株对膜的堵塞。
附图说明
[0030]图1为基于Sphingomonas YK5序列预测的蛋白结构域。
[0031]图2为突变株同源重组菌落PCR产物电泳图。
[0032]图3为菌胶团的形成现象。A为野生型YK5的成团情况，B为突变株的非成团情况。
[0033]图4为野生型及突变株的生长曲线。
[0034]图5为平板划线法检测菌株群感信号分子。
[0035]图6为TLC薄层色谱检测突变株和野生株的信号分子。S是AHL标准品，YK5是野生型菌株，
△
novI1和
△
novI2为突变株。
具体实施方式
[0036]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐
明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0037]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]下述实施例中的野生型菌株为鞘氨醇单胞菌株YK5(SphingomonasYK5，在文献Two hierarchical LuxR
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LuxI type quorum sensing systems in Novosphingobium activate microcystin degradati本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低菌胶团形成能力的细菌的构建方法，其特征在于，将鞘氨醇单胞菌基因组中的LuxI基因敲除，得到低菌胶团形成能力的细菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌YK5。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将受体菌基因组中的LuxI基因敲除为如下A1)或者A2)：A1)将鞘氨醇单胞菌的基因组中sphI1基因敲除，从而获得低菌胶团形成能力的细菌；所述sphI1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；A2)将鞘氨醇单胞菌的基因组中sphI2基因敲除，从而获得低菌胶团形成能力的细菌；所述sphI2的核苷酸序列如序列表中序列2所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述A1)方法中，鞘氨醇单胞菌中的sphI1是通过二次同...

【专利技术属性】
技术研发人员：周进，高超，曾艳华，蔡中华，杜小鹏，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：