一种重组枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其应用，涉及生物技术领域。所述重组枯草芽孢杆菌，将编码抗病毒多肽的基因与枯草芽孢杆菌中编码芽孢外壳蛋白的基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源融合表达，获得能够在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示所述抗病毒多肽的重组枯草芽孢杆菌，所述抗病毒多肽来源于新型冠状病毒SARS

【技术实现步骤摘要】
No.2所示。以枯草芽孢杆菌芽孢外壳蛋白B(CotB)为载体，构建了穿梭质粒pDG364
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CotB
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HR2P，并转化进入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168菌株。构建了一种在芽孢表面表达SARS
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CoV
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2 HR2区域衍生肽的重组枯草芽孢杆菌，命名为RBS(重组型枯草芽孢杆菌)。通过HR2P多肽对病毒的体外抑制实验，表明HR2P能有效抑制病毒对细胞的入侵，IC50＝0.995μM。在仓鼠模型中，通过滴鼻免疫来评价用重组菌株免疫后产生的免疫应答能力。结果表明，重组枯草芽孢杆菌能够有效促进仓鼠机体黏膜免疫以及特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌有望成为免疫递送载体并且开发成预防新型冠状病毒的基因工程滴鼻疫苗。
[0007]本专利技术的技术方案为：
[0008]所述的新型冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS
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CoV
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2)，采用109CFU的RBS接种仓鼠，能够刺激仓鼠机体产生有效的特异性免疫应答水平。
[0009](1)通过计算机软件LeamCoil
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VMF预测SARS
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CoV
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2 S蛋白的HR2区。将SARS
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CoV
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2与其他不同冠状病毒的HR2结构域进行序列比对，设计了一条多肽并命名为HR2P。利用大肠杆菌原核表达纯化后，通过免疫荧光测定该多肽体外抑制病毒感染的效率，显示具有较好的抑制病毒感染能力。
[0010](2)重组枯草芽孢杆菌的构建，通过以下步骤得到：
[0011](a)以Bacillus subtilis 168枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增包含CotB序列的DNA片段。
[0012](b)以pET28a
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HR2P质粒为模板扩增目的基因HR2P。
[0013](c)利用pDG364质粒做为载体，将HR2P片段与枯草芽孢杆菌的芽孢表达调控基因CotB进行串联表达，构建穿梭质粒pDG364
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CotB
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HR2P。
[0014](d)将pDG364
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CotB
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HR2P质粒转化到枯草芽孢杆菌中，通过穿梭质粒上的同源区将CotB
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HR2P整合到枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因(amy E)上，使HR2P蛋白被定向表达于枯草芽孢杆菌的芽孢壁，获得重组枯草芽孢杆菌，命名为RBS。对其进行诱导芽孢培养，验证HR2P在RBS进行了表面展示，阳性率约为70％。将获得的RBS通过滴鼻的方式免疫小鼠，结果显示，能够引起小鼠的机体特异性免疫反应应答，产生中和抗体。
[0015]SARS
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CoV
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2的受体ACE2主要在呼吸道上皮细胞上表达，SARS
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CoV
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2入侵机体首先要突破第一道屏障，即呼吸道黏膜屏障。枯草芽孢杆菌安全可靠，制备方便，成本较低；枯草芽孢杆菌为需氧菌，可在鼻腔中繁殖，细菌能使大量树突状细胞聚集，具有免疫佐剂的作用，以枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体，可充分提高其局部黏膜免疫效果，刺激机体的粘膜免疫和全身免疫。枯草芽孢杆菌安全可靠，制备方便，成本较低，通过滴鼻的方式进行免疫，操作简单，简便易行。
[0016]本专利技术的有益效果：设计并合成了基于SARS
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CoV
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2 S蛋白HR2区域的多肽HR2P。构建了一株能够在表面展示HR2P的枯草芽孢杆菌。用滴鼻的途径免疫仓鼠，能够在肠粘膜中激活粘膜免疫反应，以及引起仓鼠体内的特异性和全身性免疫反应，表明重组枯草芽孢杆菌的孢子是一种潜在的优良载体。
附图说明
[0017]图1为重组枯草芽孢杆菌孢子表面表达CotB
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HR2P的过程图。
[0018]图2为SARS
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CoV
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2(NC_045512)S蛋白HR2区域的多肽HR2P方案设计，以及多株冠状病毒HR2区域同源性比较图。
[0019]图3为抗His抗体Western blot分析：His融合蛋白的表达和纯化；其中，泳道1：空载体pET28a表达的蛋白；泳道2：表达重组HR2P
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His蛋白的大肠杆菌粗提物。
[0020]图4为HR2衍生肽对SARS
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CoV
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2的抑制作用图；将SARS
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CoV
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2类病毒(MOI＝0.01)与梯度稀释的可溶性HR2P蛋白(1、2、5、10、20μM)混合孵育Caco2
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N细胞；病毒感染检测采用GFP阳性细胞计数。
[0021]图5为流式细胞术分析WT(野生型枯草芽孢杆菌)和RBS(重组型枯草芽孢杆菌)芽孢表面CotB
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HR2P蛋白的表达图。
[0022]图6为用DSM产芽孢培养基诱导孢子后48h和72h的时间点，CotB
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HR2P在野生型枯草芽孢杆菌(WT)和重组型枯草芽孢杆菌(RBS)表面的荧光图；其中，BF，白光；IF，免疫荧光。
[0023]图7为仓鼠实验方案示意图，每组5周龄雌性仓鼠(n＝3)，给予PBS、WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)RBS(重组型芽孢)、纯化的HR2P蛋白。
[0024]图8为不同时间点仓鼠血清抗HR2P
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His总IgG(A)和肠道涮洗液抗总IgA(B)水平检测结果图；其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
具体实施方式
[0025]实施例1：HR2P衍生肽的设计和表达
[0026]SARS
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CoV
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2 S蛋白(GenBank Accession No.QHQ82464.1)HR2区是用计算机软件LeamCoil
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VMF预测的。选择了不同冠状病毒的S蛋白HR区序列比对。与非典型肺炎病毒(SARS
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CoV，GenBank Accession No.ABD72979.1)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV，GenBank Accession No.AID55079.1)，人冠状病毒NL63(HCoVNL63，GenBank Accession No.AVA26873.1)，人冠状病毒OC43(HCoV
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OC43，GenBank Accession No.CAA83661.1)，人冠状病毒299E(HCoV
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299E，GenBank Accession No.AAK32191.1)和人冠状病毒HKU1(HCo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将编码抗病毒多肽的基因与枯草芽孢杆菌中编码芽孢外壳蛋白的基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源融合表达，获得能够在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示所述抗病毒多肽的重组枯草芽孢杆菌，所述抗病毒多肽来源于新型冠状病毒SARS
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CoV
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2，命名为HR2P，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码抗病毒多肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢外壳蛋白为枯草芽孢杆菌的CotB蛋白。4.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，融合后的基因通过整合到枯草芽孢杆菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀伟，吕方理，陈楚，徐令东，王斌，郑乾坤，
申请(专利权)人：得利斯集团有限公司，
类型：发明
国别省市：