本发明专利技术提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和DNA，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体具有较高的比酶活和较大的最适温度、最适pH的范围，用于催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，转化率较高。转化率较高。转化率较高。
【技术实现步骤摘要】
烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和DNA
[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，同时本专利技术还涉及一种编码上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA以及上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法。
技术介绍
[0002]烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化烟酰胺(Nicotinamide，NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate，PRPP)合成烟酰胺单核苷酸(NMN)，是生物酶法合成NMN重要的酶。而NMN对防治癌症、帕金森病、肥胖、糖尿病及其他衰老相关疾病等有较好的治疗与康复效果。因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。
[0003]此外，制备NMN的方法中，生物酶法因无有机溶剂残留且不存在手性问题，成为最环保无公害的高效率生产方法之一，但利用生物酶法生产NMN仍然存在一些限制，例如Nampt催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成NMN，文献报道及数据库中只有来源Homo sapiens，Mus musculus和Rattus norvegicus的Nampt被表征，难以满足合成NMN的需求，缺乏可以高效催化合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶。因此，挖掘新来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶便显得很有意义。
技术实现思路
[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，催化转化率较高。
[0005]为达上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。
[0007]本专利技术进一步提出了一种编码上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
[0008]本专利技术还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
[0009]活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35
‑
38℃，转速150
‑
200rpm，培养12
‑
16h，获得种子液；
[0010]制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，当OD
600
值为0.6
‑
0.8时添加诱导剂，控制温度16
‑
25℃，诱导表达15
‑
23h，然后进行菌体破壁，冷冻离心分离，收集上清液，得到含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的粗酶液。
[0011]进一步的，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
[0012]以SEQ ID NO.2的基因为目的基因，以质粒pET
‑
28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒转化到宿主菌株中，得到所述基因
工程菌。
[0013]进一步的，所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0014]进一步的，所述TB培养基中含有45
‑
55μg
·
mL
‑1的卡那霉素。
[0015]本专利技术还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于合成烟酰胺单核苷酸的应用。
[0016]本专利技术的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体具有较高的酶活，较好的催化效率和较高的稳定性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。本专利技术的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法采用基因工程技术，获取表达本专利技术烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的基因工程菌，利用该基因工程菌生产烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，适合于目前的工业生产。本专利技术的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于催化合成烟酰胺单核苷酸的过程中，转化率较高。
附图说明
[0017]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0018]图1为本专利技术实施例1烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体粗酶液SDS
‑
PAGE电泳结果图；
[0019]图2为本专利技术实施例2测试的烟酰胺磷酸核糖转移酶的蛋白标准曲线；
[0020]图3为本专利技术实施例2测试的荧光值与产物NMN浓度的标准曲线；
[0021]图4为本专利技术实施例2测试的对烟酰胺磷酸核糖转移酶的野生型和突变体进行的温度范围的测试图；
[0022]图5为本专利技术实施例2测试的对烟酰胺磷酸核糖转移酶的野生型和突变体进行的pH范围的测试图；
具体实施方式
[0023]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0024]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。另外，除本实施例特别说明之外，本实施例中所涉及的各术语及工艺依照现有技术中的一般认知及常规方法进行理解即可。
[0025]实施例一
[0026]本实施例涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的挖掘和突变过程，包括以下步骤：
[0027](1)数据库基因挖掘、突变技术获得烟酰胺磷酸核糖转移酶基因
[0028]根据已报道的烟酰胺磷酸核糖转移酶外源表达文献，选择具有较高烟酰胺磷酸核糖转移酶活力的氨基酸序列为模板，在Uniprot数据库中检索Blast 500条，选取相似度30％
‑
90％的序列，分区间使用MEGA6构建进化树，筛去冗余序列后继续分区间使用MEGA6构建进化树，筛去部分亲缘关系较近的序列，优先选择来源为极端或嗜性微生物的蛋白序列，根据构建好的进化树，每个分支选取若干代表性序列。将保留的序列合并，使用MEGA6再次
构建进化树，按照进化距离远近，从每个分支上选取5个以上的代表序列，同样优先选择来源为极端或者嗜性微生物的蛋白序列，最终选定12条代表序列。使用ESPript 3.0(https://espript.ibcp.fr)进行位点比对，选定具有潜在的烟酰胺磷酸核糖转移酶酶活性的基因，筛选得到的基因来源于Methanobrevibactersp。
[0029](2)PCR扩增烟酰胺磷酸核糖转移酶基因
[0030]a1.来自Methanobrevibactersp的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)进行序列分析、突变和功能验证，将这些氨基酸位点进行突变，第112位的N突变为P，第232位的H突变为A，第300位的F突变为I，第334位的F突变为L，第378位的S突变为Q，第458位的D突变为E，得到如SEQ ID NO.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体Nampt
‑
M的氨基酸序列。将Nampt
‑
M进行了密本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。2.一种编码权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。3.一种权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35
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38℃，转速150
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200rpm，培养12
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16h，获得种子液；制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，当OD
600
值为0.6
‑
0.8时添加诱导剂，控制温度16
‑
25℃，诱导表达15
‑
23h，然后...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜艳军，宫睿，曹翠瑶，郑晓冰，王立晖，贺莹，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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