一株产2制造技术

本发明专利技术属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产2

【技术实现步骤摘要】
一株产2
’‑
岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一株产2
’‑
岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]母乳低聚糖(human milkoligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，在母乳中的含量约为15％。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响，实际生活中，常常出现不能使用母乳进行喂养的情况，此时一般会使用婴儿配方奶粉进行替代。目前，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)正式批准将母乳低聚糖用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。因此，工业合成2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
‘
FL)并提高产量降低生产成本已经成为目前的研究热点。
[0003]现有的工业生物合成2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法以大肠杆菌作为工程菌，在提供碳源的前提下，利用大肠杆菌内的基因通路，合成2
’‑
岩藻糖基乳糖的前体物质GDP
‑
L
‑
岩藻糖和受体乳糖，并且向工程菌中转入外源的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶，将两个前体结合，从而工业合成2
’‑
岩藻糖基乳糖。生物合成法需要供体GDP
‑
l
‑
focus、受体乳糖和α
‑
1,2
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focusyltransferase(FT)的持续供应。其中，乳糖作为一种低廉的底物，一般可以被野生型生产者自身同化和降解，这会导致工程菌的乳糖利用率下降。
[0004]GDP
‑
L
‑
岩藻糖是合成2
’‑
岩藻糖基乳糖的关键前体，可以通过两种途径合成。一种是源自colanic acid生物合成的大肠杆菌中自然存在的途径。从中枢代谢中的果糖6
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磷酸开始，通过5个酶促步骤(ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG)转化为GDP
‑
L
‑
岩藻糖。另一个是最初来源于真核细胞的补救途径，这需要昂贵的L
‑
focuse作为底物和来自fragilis(B.fragilis)的催化酶Fkp来产生GDP
‑
L
‑
岩藻糖。出于成本考虑，一般选用从头合成途径合成GDP
‑
L
‑
岩藻糖。假如参与可拉酸生物合成的wcaj基因失活，或者阳性调控基因RcsA过表达，均可以增加细胞内的GDP
‑
L
‑
岩藻糖的量，但这一途径中某些中间产物(如GDP
‑
甘露糖)的缺乏，仍可能降低GDP
‑
L
‑
岩藻糖的合成量。由于GDP
‑
L
‑
岩藻糖是合成2
’‑
岩藻糖基乳糖重要的前体物质，如何让合成途径中GDP
‑
L
‑
岩藻糖的量增多是现阶段要解决的技术难点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一株产2
’‑
岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用，利用从头合成途径合成足够多的GDP
‑
L
‑
岩藻糖，实现2
’‑
岩藻糖基乳糖的大量生产。
[0006]本专利技术提供了一株产2
’‑
岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0007](1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK；
[0008](2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK，得重组工程菌；
[0009]所述重组载体以pRSFDuet
‑
1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述
GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的，步骤(1)中，敲除wcaJ基因所用的引物包括wcaJF和sgRNAR，其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
[0011]扩增futCB基因所用的引物包括FutCBF和FutCBR，其中FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0012]优选的，步骤(1)中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法，包括：
①
以质粒pTargetF为模板，采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化和磷酸化后，利用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌trans10感受态，得阳性质粒pTargetF
‑
wcaj；
[0013]②
以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板，利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，得futCB_T7_wcaj；
[0014]③
将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109(pCas9)；
[0015]④
将阳性质粒pTargetF
‑
wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109(pCas9)的感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子；
[0016]⑤
以FutCBF和FutCBR为引物，对步骤
④
得到的转化子进行菌液PCR，测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆；
[0017]⑥
将步骤
⑤
得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，传代3次，除去pCas9质粒，得到的菌株为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
[0018]优选的，步骤(1)中敲除LacZ基因所用的引物包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R，其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，LacZ301F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产2
’‑
岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK；(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK，得重组工程菌；所述重组载体以pRSFDuet
‑
1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中，敲除wcaJ基因所用的引物包括wcaJF和sgRNAR，其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；扩增futCB基因所用的引物包括FutCBF和FutCBR，其中FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法，包括：
①
以质粒pTargetF为模板，采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化和磷酸化后，利用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌trans10感受态，得阳性质粒pTargetF
‑
wcaj；
②
以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板，利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，得futCB_T7_wcaj；
③
将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coliJm109(pCas9)；
④
将阳性质粒pTargetF
‑
wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coliJm109(pCas9)的感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子；
⑤
以FutCBF和FutCBR为引物，对步骤
④
得到的转化子进行菌液PCR，测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆；
⑥
将步骤
⑤
得到的单克隆接种到Amp+Spec抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱天择，刘珞，季立豪，高苗苗，李柚西，
申请(专利权)人：芝诺苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：