一种外泌体的保存方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。混合液中的四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％，优选为3％。本发明专利技术使用四氢嘧啶在较低温条件下长期保存外泌体，可以保持外泌体的稳定性。可以保持外泌体的稳定性。可以保持外泌体的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的保存方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种外泌体的保存方法。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)是细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的一种，大小在30～150nm，由细胞内的多泡小体(Multivesicularbodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用。此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。
[0003]外泌体具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐(PBS)缓冲液。目前，最常用的储存方法为冷冻保存，但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，也可能导致多层囊泡的形成和聚集，反复冻融会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。虽然
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80℃被公认是各种生物标本，如精液、尿、牛奶、血液和支气管肺泡灌洗液的最适宜的保存温度，但是冻融过程容易造成囊泡破坏，使外泌体中含有大量“污染物”，而且在处理或运输过程中有时很难维持这种低温条件。4℃保存虽然能够使囊泡保持良好的完整性，但是容易导致外泌体中蛋白和核酸的损失。因此，如何有效保存外泌体，一直以来都是外泌体研究领域的一个难题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足，提出一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶在较低温条件下长期保存外泌体，可以保持外泌体的稳定性。
[0005]为此，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种外泌体的保存方法，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。
[0007]优选的，所述四氢嘧啶使用前预冷30min以上。
[0008]优选的，所述混合液中的外泌体的粒子浓度为106～1012/mL。
[0009]优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％。
[0010]优选的，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为3％。
[0011]优选的，所述混合液的保存温度为
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80～4℃。
[0012]优选的，所述混合液的保存温度为4℃，周期为2周。
[0013]优选的，所述混合液的保存温度为
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20℃，周期为2个月。
[0014]本技术方案的有益之处在于：使用四氢嘧啶作为保护剂，成分简单，新鲜的外泌体使用四氢嘧啶保护剂在较低温条件下进行保存，可以提高保存效果，保持外泌体的稳定性，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化。
附图说明
[0015]图1为实验例1、3、4和对照例的外泌体粒径分布图；
[0016]图2为实验例1、3、4和对照例的外泌体的增殖能力图；
[0017]图3为实验例3在4℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
[0018]图4为实验例3在
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20℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
[0019]图5为对照例在
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80℃条件下保存不同的时间后的外泌体粒径分布图；
[0020]图6为在4℃条件下保存2周的实验例3的外泌体的透射电镜检测图；
[0021]图7为在
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20℃条件下保存6个月的实验例3的外泌体的透射电镜检测图。
具体实施方式
[0022]为了使本专利技术的目的、特征和优点更加的清晰，以下结合附图及实施例，对本专利技术的具体实施方式做出更为详细的说明，在下面的描述中，阐述了很多具体的细节以便于充分的理解本专利技术，但是本专利技术能够以很多不同于描述的其他方式来实施。因此，本专利技术不受以下公开的具体实施的限制。
[0023]实施例一
[0024]现有技术中，用于制备间充质干细胞外泌体的间充质干细胞包括：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等。在本实施例中，选择脐带间充质干细胞为实验对象。
[0025]首先，本实施例提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0026]步骤a、将P3代的脐带间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴中解冻2分钟。待内容物完全融化后，用75％酒精擦拭冻存管壁，然后将冻存管置于生物安全柜中。
[0027]步骤b、将复苏后的脐带间充质干细胞悬液转移到T75培养瓶中，然后将已经温育好的30mL细胞培养基(组成成分为：DMEM/F12+10％FBS+2mM L
‑
谷胱甘肽+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素，DMEM/F12的基础培养基可以使用α
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MEM或L
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DMEM培养基)加入T75培养瓶中，使干细胞的浓度为4
×
106/mL，将T75培养瓶置于37℃，5％CO2条件下的培养箱内，过夜培养，第二天观察细胞贴壁情况与细胞形态，然后用温育的新培养基换液。
[0028]步骤c、用显微镜观察结果，待70％～85％细胞融合后，即可开始传代培养，具体操作为：用PBS缓冲液清洗贴壁生长的细胞两遍，然后用0.25％的胰酶消化至细胞脱壁，接着加入新鲜的培养基中和胰酶，按照1:3的比例进行细胞传代培养，接种后以20％细胞融合为宜。
[0029]步骤d、3天左右后换液，观察到70％～80％细胞融合后，更换培养基为已经温育好的30mL外泌体收集培养基(DMEM/F12+10％无外泌体FBS+2mM L
‑ꢀ
谷胱甘肽+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+7μm多能菌素，基础培养基可以用α
‑
MEM或L
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DMEM培养基)，再培养48～72小时，并观察细胞的融合情况与形态。当细胞融合率达到90％以上时，即得到细胞培养液。
[0030]本实施例还提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0031]步骤a、将上述得到的细胞培养液的上清液置于离心管中，在4℃条件下，以500g离心力离心5min后，收集离心管上清液。
[0032]步骤b、将步骤a收集的离心管上清液置于离心管中，在4℃条件下，以2000g 离心
力离心30min，去除细胞碎片和蛋白聚合物后，再次收集离心管上清液。
[0033]步骤c、将步骤b收集的离心管上清液过0.22μm滤膜，得到外泌体粗提液。
[0034]步骤d、将外泌体粗提液，在4℃条件下，以10000g离心力离心1h，去除大的细胞凋亡体，收集离心管上清液。
[0035]步骤e、将步骤d收集的离心管上清液置于离心管中，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的保存方法，其特征在于，使用四氢嘧啶与外泌体混合，得到混合液进行保存。2.根据权利要求1所述的外泌体的保存方法，其特征在于，所述四氢嘧啶使用前预冷30min以上。3.根据权利要求1所述的外泌体的保存方法，其特征在于，所述混合液中的外泌体的粒子浓度为106～10
12
/mL。4.根据权利要求1所述的外泌体的保存方法，其特征在于，所述混合液中的所述四氢嘧啶的质量分数为0.5～5％。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵绍军，颜学术，
申请(专利权)人：普纳思细胞厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：