乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2

【技术实现步骤摘要】
乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2
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吡咯烷酮生产中的应用


[0001]本专利技术涉及乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2
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吡咯烷酮生产中的应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]2‑
吡咯烷酮(2
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Pyrrolidone,2P)，又称2
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氧代吡咯烷、γ
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丁内酰胺，是一类具有一个五元内酰胺环的吡咯烷类化合物，广泛存在于天然产物和各类人工合成的化合物当中。2
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吡咯烷酮是生产聚乙烯吡咯烷酮、锦纶
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4和脑复康(酰胺吡咯烷酮)的原料，在医药领域和工业领域具有广泛且重要的用途。
[0003]2‑
吡咯烷酮可由化学法或生物法合成。其中化学法合成通常由γ
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丁内酯经氨化而得。以丁二醇为原料，在200℃下，在铜催化剂存在下，生成γ
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丁内酯，再与氨(或胺)反应，可制得2
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吡咯烷酮。另一种化学合成方法为以4
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羟基丁酰胺为原料，在高压和高温下脱水进行制备。
[0004]近年来已经有一些国内外的文献报道了关于使用微生物生产2
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吡咯烷酮。目前产量最高的是，Tong Un Chae通过对大肠杆菌的改造，产量可达54g/L。通过过表达乙酰辅酶A转移酶基因act，可将γ
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氨基丁酸转化为γ
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氨基丁酸辅酶A(γ
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GABA
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CoA)，γ
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氨基丁酸辅酶A可自反环化生成2
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吡咯烷酮。
[0005]目前生物法的不足：产量比较低、发酵工艺复杂、成本高等缺陷，难以商业应用。在合成2
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吡咯烷酮时，乙酰辅酶A转移酶是其关键性酶。使用乙酰辅酶A转移酶将γ
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氨基丁酸转化为γ
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氨基丁酸辅酶A时，需要乙酰辅酶A作为辅酶A供体，因此若乙酰辅酶A不足会严重影响2
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吡咯烷酮的合成。同时在2
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吡咯烷酮合成过程中，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A转移酶催化下将产生大量的乙酸，乙酸积累可显著影响细菌生长并降低目标产物产量。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一株产2
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吡咯烷酮的谷氨酸棒杆菌底盘菌株，在谷氨酸棒杆菌FF10的基础上，表达了来源于Butyricicoccus faecihominis菌株的辅酶A转移酶，并进行了如下改进：
[0007](1)敲除丙酮酸脱氢酶poxB，并增加乌头酸水合酶的表达；
[0008](2)敲除磷酸乙酰转移酶，并增强6
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磷酸果糖激酶的表达；
[0009](3)敲除转录调节因子iolR和/或sugR，并过表达谷氨酸脱羧酶。
[0010]在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌FF10公开于公开号为CN114752544B的专利中。
[0011]在一种实施方式中，以pCES为载体，表达所述辅酶A转移酶；所述辅酶A转移酶具有Genbank登录号MCQ5130945.1所示的氨基酸序列。
[0012]在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶poxB具有Genbank登录号CAF21272.1所示的氨基酸序列；所述乌头酸水合酶具有Genbank登录号BAB98933.1所示的氨基酸序列。
[0013]在一种实施方式中，所述磷酸乙酰转移酶具有Genbank登录号：CAF20775.1所示的氨基酸序列；所述6
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磷酸果糖激酶具有Genbank登录号：BAB98643.1所示的氨基酸序列。
[0014]在一种实施方式中，所述转录调节因子iolR具有Genbank登录号ASW12947.1所示的氨基酸序列；所述转录调节因子sugR具有Genbank登录号ASW14321.1所示的氨基酸序列。
[0015]在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶为谷氨酸脱羧酶GAD MUT128，是具有D38N/I89V/D92N//E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451*突变的谷氨酸脱羧酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，已公开于公开号为CN114752589B的专利中。
[0016]在一种实施方式中，所述底盘菌株还敲除了乙酸辅酶A转移酶actA，并表达了乙酰辅酶A合成酶。
[0017]在一种实施方式中，所述乙酸辅酶A转移酶actA的Genbank登录号为CAF21230.1。
[0018]在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶来源于大肠杆菌MG1655。
[0019]在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶acs的Genbank登录号为NP_418493.1。
[0020]在一种实施方式中，用SEQ ID NO.10所示的启动子Ptuf强化乙酰辅酶A合成酶的表达。
[0021]在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶是以SEQ ID NO.2所示序列为出发序列，进行了如下至少一处突变：
[0022](1)将第72位天冬氨酸变为酪氨酸；
[0023](2)将第155位异亮氨酸变为苏氨酸；
[0024](3)将第167位丝氨酸变为苏氨酸。
[0025]本专利技术还要求保护乙酰辅酶A合成酶突变体，所述突变体含有SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
[0026]本专利技术还要求保护所述底盘菌株在发酵生产2
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吡咯烷酮中的应用。
[0027]在一种实施方式中，所述应用是将所述谷氨酸棒杆菌在CGXII培养基中发酵。
[0028]有益效果：本专利技术通过在底盘菌中过表达大肠杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶，实现高效的乙酰辅酶A循环，减少了发酵过程中乙酸积累。进一步对乙酰辅酶A合成酶进行酶工程改造，通过突变提高了乙酰辅酶A合成酶的催化活性，进而进一步提高了2
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吡咯烷酮的产量。
附图说明
[0029]图1为2
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吡咯烷酮的合成途径以及参与的基因。
[0030]图2为2
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吡咯烷酮的摇瓶发酵。
[0031]图3为乙酰辅酶A合成酶ACS及突变体酶活。
[0032]图4为携带乙酰辅酶A合成酶ACS突变体的2
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吡咯烷酮摇瓶发酵结果。
具体实施方式
[0033]培养基：
[0034]CGXII培养基：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO
4 20g/L，尿素5g/L，KH2PO
4 1g/L，K2HPO
4 1g/L，MgSO4·
7H2O 0.25g/L，CaCl2·
2H2O 13.3mg/L，MOPS 42g/L，生物素0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产2
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吡咯烷酮的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌FF10的基础上，表达了来源于Butyricicoccus faecihominis的辅酶A转移酶，并进行了(1)～(3)所示改进：(1)敲除丙酮酸脱氢酶poxB，并增加乌头酸水合酶的表达；(2)敲除磷酸乙酰转移酶，并增强6
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磷酸果糖激酶的表达；(3)敲除转录调节因子iolR和/或sugR，并过表达谷氨酸脱羧酶。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pCES为载体，表达所述辅酶A转移酶；所述辅酶A转移酶具有Genbank登录号MCQ5130945.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。4.根据权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还敲除了乙酸辅酶A转移酶，并表达了乙酰辅酶A合成酶。5.根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈升宝，宋亚楠，彭莺祺，曹利红，
申请(专利权)人：潍坊亚森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：