一种短链氯代烃诱导型生物传感器及其应用制造技术

一种短链氯代烃诱导型生物传感器及其应用，涉及基因工程生物传感器技术领域，该诱导型生物传感器具体为含有C50

【技术实现步骤摘要】
biosensors for the detection of metabolic disorders.Biosensors&bioelectronics,2022,199,113869.)，可通过生物感应元件将待测物浓度与可测信号建立浓度梯度关系，通过表达信号的强弱判断环境中污染物的浓度高低或毒性大小，在污染物的分析中具有极大的发展潜力和前景。相较于传统的物理化学检测方法，细菌生物传感器不仅反应时间快，可在一小时甚至数分钟内实现对目标物质浓度的分析，而且容易操作。由于细菌生物传感器的核心即是细菌本身，其易于培养及成本极其廉价，利于推广和应用。更为重要的是，细菌生物传感器不仅可以检测环境中氯代烃的含量，还可以准确反映环境中氯代烃进入生物体内的量及其生物毒性，对氯代烃的毒理作出指导性评估。与传统方法相比，生物传感器具有快速、经济、操作简便等优点，是检测环境中污染物生物有效性的理想工具。
[0007]鉴于短链氯代烃污染的严重性，以及细菌生物传感器对于氯代烃污染检测的巨大前景和优越性。本专利技术通过定向进化手段获得能够检测氯代烃诱导型操纵子从而建立能够检测短链氯代烃的细菌生物传感器具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种短链氯代烃诱导型生物传感器及其应用，以解决现有技术的基于转录因子构建的细菌生物传感器无法检测短链氯代烃的问题。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种短链氯代烃诱导型生物传感器，具体为含有C50
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AlkS
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EGFP载体的Top10工程菌，其中AlkS及其操纵子基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0010]本专利技术还提出了该短链氯代烃诱导型生物传感器的制备方法，步骤如下：
[0011]1)、野生型氯代烃诱导型操纵子基因的获得：
[0012]以质粒pCOM8
‑
Alks为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的引物做PCR扩增，获得EGFP基因和包括启动子PalkS、PalkB和调节蛋白AlkS的烷烃操纵子基因；
[0013]2)、野生型氯代烃诱导型重组载体的构建：
[0014]利用EcoRI和XhoI酶切pUC18载体和步骤1)扩增获得的PCR产物，T4连接酶连接，使野生型氯代烃诱导型操纵子替代pUC18载体中原本的lac启动子，获得野生型氯代烃诱导型重组载体AlkS
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EGFP；
[0015]同步构建AID
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EGFP空白对照质粒，用含有多克隆位点的(MCS)无功能序列AID替换AlkS
‑
EGFP质粒中的氯代烃诱导型操纵子，所述AID序列是以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物，以pCI
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mAID为模板克隆获得的；
[0016]3)、定向进化获得氯代烃诱导型生物传感器：
[0017]以AlkS
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EGFP质粒为模板，对烷烃诱导型操纵子基因进行易错PCR，获得随机突变体文库，随后用改突变基因替换AID
‑
EGFP质粒中的AID基因，构建重组突变体文库，其中连接体系中，插入片段和载体的摩尔比为4:1，或在每100ul连接体系中加入50ng载体以及200ng片段，连接反应条件为22℃连接30min；连接产物经电转化，导入Top10感受态细胞，获得流式筛选文库，进行流式高通量筛选；所述易错PCR的引物如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
[0018]经过三轮流式高通量筛选，最终获得进化后的含有C50
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AlkS
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EGFP质粒载体的Top10工程菌，即为进化后的细菌生物传感器，其中的AlkS及其操纵子基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0019]优选地，制备方法中所述易错PCR的反应体系为：
[0020][0021]所述易错PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸2.5min，25个循环后，再在72℃下继续延伸10min后，置于4℃下保存备用。
[0022]本专利技术还提出了该诱导型生物传感器在检测短链氯代烃中的应用，步骤如下：
[0023]1)将细菌生物传感器C50
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AlkS
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EGFP接种于含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜；同时，接种一份野生型氯代烃诱导型传感器AID
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EGFP，作对照；
[0024]2)分别挑取野生型和进化后的传感器单菌落，接种于1mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm下过夜培养，获得检测菌液；
[0025]3)将检测菌液用上述含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基稀释50倍，获得稀释菌液，继续培养至对数期；
[0026]4)准备一系列短链氯代烃标准品；
[0027]5)对数期菌液加入终浓度为5mg/L的氯代烃标准品，作为诱导组；同步取对数期菌液加入等量去离子水，作为空白对照；在37℃，200rpm下培养1h，获得诱导菌液；
[0028]6)将诱导后的菌液置于离心机中5000rpm离心3min，弃上清；
[0029]7)1
×
M9缓冲液重悬后再次离心，反复漂洗3次最后使用1
×
PBS重悬，流式细胞仪检测荧光表达。
[0030]本专利技术提出的诱导型生物传感器有很强的底物特异性，对短链氯代烃响应，对烷烃不再响应。能够检测诸如一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、一氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、一氯乙烯、二氯乙烯、三氯乙烯以及四氯乙烯等短链氯代烃。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果表现在：
[0032]1、本专利技术所采用的氯代烃诱导型操纵子是野生型烷烃诱导型启动子的突变子，基于该操纵子优化的氯代烃诱导型细菌生物传感器，成功实现了可同时对多种短链氯代烃的检测。
[0033]2、通过定向进化和流式高通量的双向筛选策略获得的氯代烃生物传感器具有低
背景荧光泄露，高诱导荧光表达的优势，表现出极高的灵敏度和特异性，对短链氯代烃响应，对原本的烷烃不再响应(进化前野生型生物传感器能够对烷烃响应，但对氯代烃不响应)。
[0034]3、该生物传感器对氯代烃的检测易于操作，制样过程简单快捷。其检测限高，具有良好的重复性。大大提高了检测效率，而且降低试剂成本。
附图说明
[0035]图1分别为C50
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Alks
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EGFP(A)、AID
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EGFP(B)的质粒图谱。
[0036]图2为野生型细菌生物传感器(WT
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AlkS)和进化后的细菌生物传感器(C50
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AlkS)对短链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种短链氯代烃诱导型生物传感器，具体为含有C50
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AlkS
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EGFP载体的Top10工程菌，其中AlkS及其操纵子基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种制备如权利要求1所述短链氯代烃诱导型生物传感器的方法，其特征在于，步骤如下：1)、野生型氯代烃诱导型操纵子基因的获得：以质粒pCOM8
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Alks为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的引物做PCR扩增，获得EGFP基因和包括启动子PalkS、PalkB和调节蛋白AlkS的烷烃操纵子基因；2)、野生型氯代烃诱导型重组载体的构建：利用EcoRI和XhoI酶切pUC18载体和步骤1)扩增获得的PCR产物，T4连接酶连接，使野生型氯代烃诱导型操纵子替代pUC18载体中原本的lac启动子，获得野生型氯代烃诱导型重组载体AlkS
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EGFP；同步构建AID
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EGFP空白对照质粒，用含有多克隆位点的(MCS)无功能序列AID替换AlkS
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EGFP质粒中的氯代烃诱导型操纵子，所述AID序列是以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物，以pCI
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mAID为模板克隆获得的；3)、定向进化获得氯代烃诱导型生物传感器：以AlkS
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EGFP质粒为模板，对烷烃诱导型操纵子基因进行易错PCR，获得随机突变体文库，随后用改突变基因替换AID
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EGFP质粒中的AID基因，构建重组突变体文库，其中连接体系中，插入片段和载体的摩尔比为4:1，或在每100ul连接体系中加入50ng载体以及200ng片段，连接反应条件为22℃连接30min；连接产物经电转化，导入Top10感受态细胞，获得流式筛选文库，进行流式高通量筛选；所述易错PCR的引物如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；经过三轮流式高通量筛选，最终获得进化后的含有C50
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴李君，陈东东，赵加迪，徐升敏，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：