一种提高L-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌技术

本发明专利技术公开了一种提高L

【技术实现步骤摘要】
一种提高L
‑
缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高L
‑
缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌。

技术介绍

[0002]L
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缬氨酸在食品、医药、保健品﹑饲料等领域均有着重要的应用。在食品领域，L
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缬氨酸可以补充营养，促进身体生长，提供能量。在医药领域，L
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缬氨酸可用于输液和注射液，促进外科创伤愈合。国内饲料级L
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缬氨酸的出口量达到3万吨以上，年均增长率20%。
[0003]目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L
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缬氨酸的生产但大肠杆菌对L
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缬氨酸非常敏感，当L
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缬氨酸生产菌胞内的L
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缬氨酸不能及时排出产生积累时，会严重抑制大肠杆菌的生长，进而导致菌胞内L
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缬氨酸的合成受到抑制，导致L
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缬氨酸的产量非常低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的为如何提高L
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氨基酸的产量，本专利技术的目的不限于所描述的主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它目的。
[0005]本专利技术首先保护一种工程菌甲，可为体内抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性的微生物；所述微生物可以生产缬氨酸。
[0006]所述硫胺磷酸合酶为E1）、E2）或E3）：E1）氨基酸序列如SEQ ID No：6所示的蛋白质；E2）将E1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；E3）在E1）或E2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0007]上述工程菌甲中，所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。
[0008]所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：3所示的ΔthiE
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Up
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Down片段实现。
[0009]上述工程菌甲的体内还抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。
[0010]所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：F1）氨基酸序列如SEQ ID No：7所示的蛋白质；F2）将F1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；F3）在F1）或F2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0011]上述工程菌甲中，所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
[0012]所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例
提及的pGRB
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mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的Δmdh
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Up
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Down片段实现。
[0013]本专利技术还保护一种工程菌乙，可为体内抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性的微生物；所述微生物可以生产缬氨酸。
[0014]所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：F1）氨基酸序列如SEQ ID No：7所示的蛋白质；F2）将F1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；F3）在F1）或F2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0015]上述工程菌乙中，所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
[0016]所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的Δmdh
‑
Up
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Down片段实现。
[0017]本专利技术还保护一种制备生产缬氨酸的工程菌的方法，可包括步骤（a1）：降低微生物中上述任一所述硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性；所述微生物可以生产缬氨酸。
[0018]所述制备方法中，所述降低所述微生物中硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。
[0019]所述降低微生物中上述任一所述硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：3所示的ΔthiE
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Up
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Down片段实现。
[0020]所述制备方法还包括步骤（a2）：完成步骤（a1）后，降低所述微生物中上述任一所述苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。
[0021]所述制备方法中，所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
[0022]所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的Δmdh
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Up
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Down片段实现。
[0023]本专利技术还保护一种制备生产缬氨酸的工程菌的方法，可包括步骤（b1）：降低微生物中上述任一所述苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性；所述微生物可以生产缬氨酸。
[0024]所述制备方法中，所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
[0025]所述降低所述微生物中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：5所示的Δmdh
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Up
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Down片段实现。
[0026]本专利技术还保护上述任一所述工程菌甲、上述任一所述工程菌乙或上述任一所述的方法制备的工程菌的应用，可为A1）、A2）或A3）：A1）生产L
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氨基酸；A2）制备用于生产L
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氨基酸的产品；A3）制备含有L
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氨基酸的食品、饲料或药品。
[0027]本专利技术还保护一种生产或制备L
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氨基酸的方法，包括如下步骤：发酵培养上述任一所述的工程菌甲、工程菌乙或上述任一所述的方法制备的工程菌，收集发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程菌，为体内抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性且抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性的大肠杆菌；所述大肠杆菌可以生产缬氨酸；所述硫胺磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。2.制备生产缬氨酸的工程菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：降低大肠杆菌中硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性且降低所述大肠杆菌中苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性；所述大肠杆菌可以生产缬氨酸；所述硫胺磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述降低大肠杆菌中硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低大肠杆菌中氨基酸序列如SEQ ID No：6所示的硫胺磷酸合酶的编码基因来实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟刚，魏爱英，苏厚波，赵春光，张晓琴，张英，王攀，毕国东，付丽霞，
申请(专利权)人：北京中科伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：