用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了用于生产L

【技术实现步骤摘要】
用于生产L
‑
缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
中，用于生产L
‑
缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]在微生物中，L
‑
缬氨酸(支链氨基酸的一种)是从丙酮酸开始，经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸生物合成的。通过乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的反应产生这些中间代谢产物。然而，这些酶还参与从丁酮酸和丙酮酸开始的L
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异亮氨酸的生物合成，而且L
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亮氨酸也从酮异戊酸(一种中间代谢产物)开始，经由2
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异丙基苹果酸、3
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异丙基苹果酸和酮异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸(即L
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缬氨酸、L
‑
异亮氨酸和L
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亮氨酸)使用相同的酶用于其生物合成过程，所以已知工业上通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产受到由L
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缬氨酸(其为终产物)或其衍生物引起的反馈抑制的限制。
[0003]大肠杆菌具有明确的遗传背景，是氨基酸生产中具有吸引力的工业化生产底盘。然而，相比于谷氨酸棒杆菌，生产L
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缬氨酸的大肠杆菌菌株的相关报道较少，这可能是由于大肠杆菌对L
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缬氨酸生物合成的调节机制更为复杂。乙酰羟基酸合酶(AHAS)是L
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缬氨酸生物合成的限速酶，大肠杆菌有三种AHAS同工酶，由ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，具有不同的性质和调节机制。Park等人报道了通过Escherichia coli W3110和Escherichia coli W的系统代谢工程改造L
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缬氨酸生产菌株，其L
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缬氨酸终产量达到60.7g/L，糖酸转化率为0.22g/g。除了诱变育种和常规代谢工程修饰外，辅因子平衡也被认为是提高L
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缬氨酸产量的关键瓶颈。由于胞内辅因子影响代谢网络、信号转导和物质运输，进而影响微生物细胞的生理功能。在微生物发酵生产化学品的过程中，化学品的效价和产量往往受到辅因子不平衡的限制，这主要是由合成途径中辅因子依赖酶的不平衡表达引起的。Savrasova和Stoynova等人通过用异源NADH依赖性亮氨酸脱氢酶替换天然NADPH依赖性转氨酶，构建了一株以大肠杆菌MG1655为出发菌株的L
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缬氨酸工程菌。在微需氧条件下，该菌株的糖酸转化率(0.23g/g)仅为最大理论产量0.65g/g的35.4％。开发生物传感器高通量筛选方法，引入外源辅酶再生途径以平衡胞内辅因子，构建高效的工业底盘生产菌株，是需要解决关键科学问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高L
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缬氨酸产量。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于生产缬氨酸的工程菌，所述工程菌为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A5）；A5）包括A51）和A52）：A51）敲除所述受体菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；A52）增加所述受体菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋
白质的活性。
[0006]其中，所述受体菌含有ycgH基因（GeneID:2847703，更新日期2023
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04
‑
14）。
[0007]上述工程菌中，所述ilvC基因可来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0008]上述工程菌中，所述ilvC基因可编码序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质。
[0009]上述工程菌中，所述ilvC基因可为序列表中SEQ ID No.11的第794
‑
2269位所示的DNA分子。
[0010]所述ilvC基因的表达由能在所述工程菌中启动所述ilvC基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。
[0011]在本专利技术的另一个实施例中，所述ilvC基因的表达由Ptrc启动子启动，所述Ptrc启动子为SEQ ID No.11的第2270
‑
2343位所示的DNA分子。
[0012]A5）可通过CRISPR/Cas9系统，利用靶向ycgH基因的sgRNA与作为供体的SEQ ID No.11所示的DNA片段进行基因编辑实现。
[0013]上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0014]上述工程菌中，所述改造还可包括A1）、A2）、A3）和A4）：A1）包括A11）、A12）和A13）：A11）敲除所述受体菌的yjiT基因，抑制所述yjiT基因的表达或抑制所述yjiT基因编码的蛋白质的活性；A12）增加所述受体菌中brnF基因编码蛋白质的含量或增强所述brnF基因编码蛋白质的活性；A13）增加所述受体菌中brnE基因编码蛋白质的含量或增强所述brnE基因编码蛋白质的活性；A2）包括A21）、A22）和A23）：A21）敲除所述受体菌的yjiV基因，抑制所述yjiV基因的表达或抑制所述yjiV基因编码的蛋白质的活性；A22）增加所述受体菌中ilvE基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvE基因编码蛋白质的活性；A23）增加所述受体菌中ilvD基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvD基因编码蛋白质的活性；A3）包括A31）和A32）：A31）敲除所述受体菌的trpR基因，抑制所述trpR基因的表达或抑制所述trpR基因编码的蛋白质的活性；A32）增加所述受体菌中ilvH
G14D 、S17F
基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvH
G14D 、S17F
基因编码蛋白质的活性；所述ilvH
G14D 、S17F
基因由将ilvH基因中第14位甘氨酸密码子替换为天冬氨酸密码子、第17位丝氨酸密码子替换为苯丙氨酸密码子得到；A4）包括A41）、A42）和A43）：A41）敲除所述受体菌的lacI基因，抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；A42）敲除所述受体菌的lacZ基因，抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基因编码的蛋白质的活性；
A43）增加所述受体菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性。
[0015]其中，所述受体菌还含有yjiT基因（GeneID:945056，更新日期2023
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04
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14）、yjiV基因（GeneID:2847669，更新日期2023
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04
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14）、trpR基因（GeneID:948917，更新日期2023
‑
04
‑
14）、lacI基因（Ge本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产缬氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为对受体大肠杆菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A5）；A5）包括A51）和A52）：A51）敲除所述受体大肠杆菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；A52）增加所述受体大肠杆菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋白质的活性。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于：所述ilvC基因来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于：所述ilvC基因编码序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于：所述ilvC基因为序列表中SEQ ID No.11的第794
‑
2269位所示的DNA分子。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的大肠杆菌，其特征在于：所述改造还包括A1）、A2）、A3）和A4）：A1）包括A11）、A12）和A13）：A11）敲除所述受体大肠杆菌的yjiT基因，抑制所述yjiT基因的表达或抑制所述yjiT基因编码的蛋白质的活性；A12）增加所述受体大肠杆菌中brnF基因编码蛋白质的含量或增强所述brnF基因编码蛋白质的活性；A13）增加所述受体大肠杆菌中brnE基因编码蛋白质的含量或增强所述brnE基因编码蛋白质的活性；A2）包括A21）、A22）和A23）：A21）敲除所述受体大肠杆菌的yjiV基因，抑制所述yjiV基因的表达或抑制所述yjiV基因编码的蛋白质的活性；A22）增加所述受体大肠杆菌中ilvE基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvE基因编码蛋白质的活性；A23）增加所述受体大肠杆菌中ilvD基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvD基因编码蛋白质的活性；A3）包括A31）和A32）：A31）敲除所述受体大肠杆菌的trpR基因，抑制所述trpR基因的表达或抑制所述trpR基因编码的蛋白质的活性；A32）增加所述受体大肠杆菌中ilvH
G14D 、S17F
基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvH
G14D 、S17F
基因编码蛋白质的活性；所述ilvH
G14D 、S17F
基因由将ilvH基因中第14位甘氨酸密码子替换为天冬氨酸密码子、第17位丝氨酸密码子替换为苯丙氨酸密码子得到；A4）包括A41）、A42）和A43）：A41）敲除所述受体大肠杆菌的lacI基因，抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；A42）敲除所述受体大肠杆菌的lacZ基因，抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基
因编码的蛋白质的活性；A43）增加所述受体大肠杆菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性；所述brnF基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓群，魏爱英，孟刚，赵春光，张晓琴，毕国东，杨立鹏，蔡卫卫，王攀，
申请(专利权)人：黑龙江伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：