一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。本发明专利技术提供的阿克曼氏菌分离培养基以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素。采用本发明专利技术提供的培养基对粪便样品中阿克曼氏菌的分离具有极大的促进作用，能够更有效地排除杂菌对阿克曼氏菌株分离的影响，相较于原始分离方法，分离效率明显更高，分离获得阿克曼氏菌的成功率显著提高。本发明专利技术的培养基还具有组成简单、成本低的优势，分离方法简单易行，适于推广应用。适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。

技术介绍

[0002]阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）作为一种常见的肠道厌氧菌，距离2004年首次成功分离至今已有十余年。然而，目前只有非常有限的阿克曼氏菌菌株被成功分离和培养，可能原因是阿克曼氏菌对氧气的敏感性和易受杂菌生长影响的微小菌落形态。近年来宏基因组学和高通量等新型测序技术极大地丰富了微生物的检测手段。虽然组学有望帮助人们深入了解肠道菌群的菌落结构，但为了更好地利用有益微生物，有必要对更多的阿克曼氏菌菌株进行分离纯化，因此，需要开发高效的阿克曼氏菌分离培养基和分离方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种阿克曼氏菌分离培养基以及从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法。
[0004]粪便样品中的微生物菌群复杂多样，阿克曼氏菌因其对营养要求较为严格，生长较慢，菌落微小，导致粪便中很多微生物均会对其分离筛选造成干扰，进而造成阿克曼氏菌的分离失败或分离效率降低。本专利技术在针对粪便样品分离阿克曼氏菌的研究中意外地发现，通过在分离筛选过程中添加万古霉素和红霉素，两种抗生素联用既能够有效抑制粪便样品中其他微生物的生长，同时还不会对阿克曼氏菌的生长产生抑制作用，进而显著提高了阿克曼氏菌的分离效率。
[0005]具体地，本专利技术提供以下技术方案：第一方面，本专利技术提供万古霉素和红霉素在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
[0006]具体地，所述应用为：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和/或阿克曼氏菌的分离培养；其中，万古霉素的添加浓度为4
‑
6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3
‑
0.5μg/mL。
[0007]本专利技术发现，在上述浓度下将红霉素与万古霉素联用，即可显著抑制杂菌的生长，同时又不会对阿克曼氏菌的生长产生抑制。
[0008]优选地，上述应用包括：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和阿克曼氏菌的分离培养，在富集培养和分离培养使用的培养基中，万古霉素的添加浓度为4
‑
6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3
‑
0.5μg/mL。
[0009]进一步优选地，上述应用包括：将粪便样品置于含有万古霉素4
‑
6μg/mL、红霉素0.3
‑
0.5μg/mL的富集培养用培养基中进行富集培养，得到样品富集液；对样品富集液进行初步筛选鉴定，将鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液在含有万古霉素4
‑
6μg/mL、红霉素
0.5
‑
0.6g/L，氯化钠 0.2
‑
0.4 g/L，氯化铵 0.2
‑
0.4 g/L，氯化镁 0.05
‑
0.2g/L，氯化钙 0.1
‑
0.2g/L，碳酸氢钠3
‑
5 g/L，L
‑
半胱氨酸盐酸盐 0.4
‑
0.6g/L，黏蛋白2
‑
4g/L，Coolaber 1000
×
B6微量元素溶液 0.8
‑
1.2mL/L，万古霉素4
‑
6μg/mL，红霉素0.3
‑
0.5μg/mL。采用上述第二培养基进行粪便样品的富集培养能够有效抑制样品富集液中杂菌的生长繁殖，并为阿克曼氏菌的生长提供必要的营养元素，提高阿克曼氏菌的分离成功率和效率。
[0023]优选地，所述第二培养基还包含琼脂15
‑
25g/L。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述第二培养基包含以下组分：磷酸二氢钾 0.35
‑
0.45g/L，磷酸氢二钠 0.5
‑
0.55 g/L，氯化钠 0.25
‑
0.35 g/L，氯化铵 0.25
‑
0.35 g/L，氯化镁 0.08
‑
0.12 g/L，氯化钙 0.1
‑
0.15 g/L，碳酸氢钠 3.5
‑
4.5 g/L，L
‑
半胱氨酸盐酸盐 0.45
‑
0.55 g/L，黏蛋白 2
‑
4 g/L，Coolaber 1000
×
B6微量元素溶液 0.9
‑
1.1mL/L，万古霉素4
‑
5μg/mL，红霉素0.3
‑
0.4μg/mL，琼脂 15
‑
25 g/L，以水为溶剂。作为示例本专利技术在实施例中提供了上述第二培养基中的一种，经验证，上述第二培养基均能够取得与实施例中所示培养基相当的富集和分离效果。
[0025]上述第一培养基、第二培养基的pH优选为6.5
‑
8.0，更优选为7.0
‑
8.0。
[0026]本专利技术中，上述第一培养基能够显著增加样品富集液中阿克曼氏菌的丰度，减少其他杂菌的丰度影响；第二培养基能够有效减少其他杂菌生长，排除杂菌影响，增加阿克曼氏菌分离成功率。
[0027]第三方面，本专利技术提供以上所述的阿克曼氏菌分离培养基在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。
[0028]优选地，上述粪便样品为来源于人的粪便样品。
[0029]第四方面，本专利技术提供一种从粪便样品中分离阿克曼氏菌的方法，所述方法包括：将粪便样品置于以上所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第一培养基中进行富集培养得到样品富集液；对样品富集液进行初步筛选鉴定，将鉴定含有阿克曼氏菌的样品富集液在以上所述的阿克曼氏菌分离培养基中的第二培养基中进行分离培养，对分离得到的菌株进行阿克曼氏菌的鉴定。
[0030]上述方法中，所述初步筛选鉴定为以样品富集液的DNA为模板，以阿克曼氏菌特异性引物进行PCR扩增，根据扩增产物判断样品富集液中是否含有阿克曼氏菌；所述阿克曼氏菌特异性引物为上游引物AKKF
‑
1和下游引物AKKR
‑
2，其中，上游引物AKKF
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物AKKR
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0031]上述引物的核苷酸序列具体如下：上游引物AKKF
‑
1：5
’‑
CATGTGAAAGCATGCGACTC
‑3’
；下游引物AKKR
‑
2：5
’‑
CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT
‑3’
。
[0032]上述阿克曼氏菌特异性引物为本专利技术针对粪便样品的菌群特点以及阿克曼氏菌设计，可实现快速、简便地检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.万古霉素和红霉素在从粪便样品中分离阿克曼氏菌中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为：以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素用于粪便样品的富集培养和/或阿克曼氏菌的分离培养；其中，万古霉素的添加浓度为4
‑
6μg/mL，红霉素的添加浓度为0.3
‑
0.5μg/mL。3.一种阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基以万古霉素和红霉素作为筛选抗生素。4.根据权利要求3所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基中，万古霉素的浓度为4
‑
6μg/mL，红霉素的浓度为0.3
‑
0.5μg/mL。5.根据权利要求4所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述培养基包含：第一培养基，为液体培养基，用于粪便样品的富集培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸、益生元和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含脑心浸粉15
‑
20g/L，黏蛋白2
‑
4g/L，蛋白胨5
‑
15 g/L，葡萄糖1
‑
3 g/L；第二培养基，为固体培养基，用于阿克曼氏菌的分离培养，包含：碳源和氮源、无机盐、氨基酸和筛选抗生素；其中，所述碳源和氮源包含黏蛋白2
‑
4 g/L。6.根据权利要求5所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述第一培养基中，无机盐包含氯化钠、磷酸氢二钠和微量元素，氨基酸包含L
‑
半胱氨酸或其盐，益生元包含菊粉；和/或，所述第二培养基中，无机盐包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化铵、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠和微量元素，氨基酸包含L
‑
半胱氨酸或其盐。7.根据权利要求5或6所述的阿克曼氏菌分离培养基，其特征在于，所述第一培养基包含以下组分：蛋白胨8
‑
12g/L，牛脑浸粉 10
‑
15g/L，牛心浸粉4
‑
8g/L，氯化钠 3
‑
7g/L，葡萄糖1
‑
3g/L，磷酸氢二钠 2
‑
3g/L，黏蛋白2
‑
4g/L，L
‑
半胱氨酸盐酸盐0.3
‑
0.8 g/L，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂山，徐格，吴洁，刘涵虚，张颖婷，
申请(专利权)人：安徽博泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：