一种重组微生物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种重组微生物及其构建方法和应用。本发明专利技术通过构建磷酸乙酰转移酶失活的菌株并将其应用于苏氨酸生产，显著提高了菌株生产苏氨酸的能力，菌株的苏氨酸产量较未经改造的菌株显著提高；结合乙酸激酶、HTH转录调控因子等的表达弱化或失活以及丙酮酸羧化酶和苏氨酸合成相关途径的酶的活性增强，苏氨酸的产量进一步提升。上述改造可用于苏氨酸的发酵生产中，具有较好的应用价值。较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种重组微生物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及一种重组微生物及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]苏氨酸(Threonin，β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸)的分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12，是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒状杆菌是苏氨酸发酵的重要生产菌。在谷氨酸棒状杆菌中，草酰乙酸经天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)五步催化反应生成苏氨酸。目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，但是，极少有关于苏氨酸的前体供应和苏氨酸合成过程中丙酮酸的代谢溢流的代谢工程改造的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是通过失活磷酸乙酰转移酶使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种生产苏氨酸的重组微生物。本专利技术还提供该重组微生物的构建方法和应用。
[0005]目前关于利用谷氨酸棒状杆菌合成苏氨酸的代谢工程改造主要集中在草酰乙酸到苏氨酸的合成路径。丙酮酸作为微生物代谢网络中重要的中间代谢产物，主要进入三羧酸循环为菌体生长提供能量和前体物质，然而，当上下游代谢通路不平衡时会造成丙酮酸的代谢溢流，从而造成丙酮酸的浪费。虽然苏氨酸的前体是草酰乙酸，但草酰乙酸可以通过丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成，同时也可由丙酮酸进入三羧酸循环经过一系列的酶催化反应生成。本专利技术在苏氨酸的代谢工程研究过程中发现，通过减少丙酮酸的代谢溢流，能够提高丙酮酸向苏氨酸合成前体草酰乙酸的流量，进而促进苏氨酸的合成。而与其它减少丙酮酸代谢溢流的方法相比，降低或丧失磷酸乙酰转移酶的活性的效果明显更优，通过降低或丧失磷酸乙酰转移酶的活性能够有效减少丙酮酸代谢溢流，提高苏氨酸合成前体的供应，进而显著提高菌株的苏氨酸合成能力。
[0006]为实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其磷酸乙酰转移酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
[0007]优选地，磷酸乙酰转移酶在NCBI上的参考序列编号为NP_601948.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]进一步地，所述微生物体内磷酸乙酰转移酶的活性降低或丧失是通过降低编码磷酸乙酰转移酶基因的表达或敲除内源的编码磷酸乙酰转移酶的基因来实现的。
[0009]可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码磷酸乙酰转移酶基因的表达或敲除内源的编码磷酸乙酰转移酶的基因。
[0010]进一步地，所述微生物相比于未修饰的微生物，其丙酮酸羧化酶的活性增强和/或
解除反馈抑制。
[0011]优选地，丙酮酸羧化酶在NCBI上的参考序列编号为WP_011013816.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0012]进一步地，所述微生物相比于未修饰的微生物，以下(1)～(2)中的任意一个或两个酶的活性降低或丧失：
[0013](1)乙酸激酶；
[0014](2)HTH转录调控因子。
[0015]优选地，乙酸激酶、HTH转录调控因子在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003862874.1、WP_003859703.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0016]进一步地，所述微生物相比于未修饰的微生物，其体内与苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强和/或解除反馈抑制；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种。
[0017]优选地，天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003855724.1、WP_003855724.1、WP_011014964.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0018]优选地，所述微生物为如下
①
～
④
中的任一种：
[0019]①
磷酸乙酰转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0020]②
磷酸乙酰转移酶和/或乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0021]③
磷酸乙酰转移酶和/或HTH转录调控因子活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0022]④
磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、HTH转录调控因子中的至少一个的活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物。
[0023]上述酶的活性增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
[0024]1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0025]2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0026]3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0027]4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0028]5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
[0029]6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。
[0030]优选地，酶的活性增强通过将所述酶的编码基因的原始启动子替换为活性更强的强启动子，和/或，将基因的起始密码子突变为ATG实现。
[0031]其中，所述强启动子包括Psod或PcspB。
[0032]启动子Psod、PcspB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。
[0033]优选地，丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶的活性增强通过将其原始启动子替换为Psod启动子实现；
[0034]高丝氨酸脱氢酶的活性增强通过将其原始启动子替换为PcspB启动子实现。
[0035]以上所述的解除反馈抑制优选通过以下突变实现：丙酮酸羧化酶的解除反馈抑制通过将丙酮酸羧化酶编码基因突变，使得其编码的丙酮酸羧化酶发生P458S突变实现；
[0036]天冬氨酸激酶的解除反馈抑制通过将天冬氨酸激酶编码基因突变，使得其编码的天冬氨酸激酶发生T311I突变实现。
[0037]高丝氨酸脱氢酶的解除反馈抑制通过将高丝氨酸脱氢酶编码基因突变，使得高丝氨酸脱氢酶发生G378E突变实现。
[0038]优选地，本专利技术所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其磷酸乙酰转移酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内磷酸乙酰转移酶的活性降低或丧失是通过降低编码磷酸乙酰转移酶基因的表达或敲除内源的编码磷酸乙酰转移酶的基因来实现的。3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码磷酸乙酰转移酶基因的表达或敲除内源的编码磷酸乙酰转移酶的基因。4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其丙酮酸羧化酶的活性增强和/或解除反馈抑制。5.根据权利要求1或4所述的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，以下(1)～(2)中的任意一个或两个酶的活性降低或丧失：(1)乙酸激酶；(2)HTH转录调控因子。6.根据权利要求1～5任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其体内与苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强和/或解除反馈抑制；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种。7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下
①
～
④
中的任一种：
①
磷酸乙酰转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
②
磷酸乙酰转移酶和/或乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
③
磷酸乙酰转移酶和/或HTH转录调控因子活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
④
磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、HTH转录调控因子中的至少一个的活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，王晨，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：