酸性蛋白酶AGP及其制备方法和应用技术

本申请提供了酸性蛋白酶AGP及其制备方法和应用。制备酸性蛋白酶AGP的方法包括：将目的基因接入表达载体中，构建重组质粒；将所述重组质粒转化到感受态细胞之后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达；从诱导表达的蛋白中纯化得到酸性蛋白酶AGP。本申请提供的酸性蛋白水解酶AGP具有以下特点：在酸性条件(pH 2.5)和低温、少量变性剂和还原剂存在条件下依然保持比较强的活性；具有广泛的酶切位点，主要酶切位点为天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)等，与Pepsin酶切位点具有高度互补性；AGP酶切时产生的肽段长度比Pepsin产生的肽段更短。产生的肽段长度比Pepsin产生的肽段更短。产生的肽段长度比Pepsin产生的肽段更短。

【技术实现步骤摘要】
酸性蛋白酶AGP及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物质谱
，更具体地，涉及酸性蛋白酶AGP及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]蛋白质是生命的基础，一切生命的表现形式，本质上都是蛋白质功能的体现。了解细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质的结构和动态变化，会对疾病的发生、发展等过程有一个全面的认识，把握疾病诊治的关键，提高药物开发的效率。
[0003]氢氘交换质谱(Hydrogen Deuterium Exchange Mass spectrometry,HDX
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MS)是研究蛋白质结构的常见手段，该技术利用质谱监测蛋白骨架中酰胺氢与氘水发生交换的特性，反映蛋白质在溶液中的构象特征和动态变化。HDX
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MS凭借分析快速、灵敏、样品消耗量少，适用于复杂蛋白体系分析等优势，目前已广泛应用于膜蛋白相互作用、抗体、甚至蛋白质组装和病毒研究中。由于HDX
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MS主要以自下而上(Bottom up)蛋白组学方法为主，因此在MS分析之前需要采用蛋白酶酶切产生多肽。为了尽量减少氘标记蛋白表面氘与氢的回交，蛋白质样品在氘代溶液中孵育一定时间后，在pH 2.5和0℃条件下终止反应。一般来说，实验中加入猝灭溶液并调至pH 2.5，同时控制温度为0℃，从而将HDX回交速率控制到最低。但根据不同蛋白样品的性质，猝灭溶液中也会加入不同浓度的变性剂(尿素或盐酸胍)和还原剂(TCEP)帮助蛋白质变性还原，从而提高酶切效果以及序列覆盖率。为了防止在后续的分析中发生回交，猝灭之后的所有步骤都应在pH 2.5和低温下尽快完成，并利用酸性蛋白酶如胃蛋白酶(pepsin)将蛋白质酶切为肽段。一般来说，应用于HDX
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MS中的蛋白酶必须满足以下关键标准，首先，在pH2.5和低温下保持活性；其次，具有广泛的酶切位点，以最大限度覆盖蛋白序列以及序列覆盖冗余度，从而获取高结构分辨率；此外，一定程度的兼容变性剂以及还原剂可以有效拓展蛋白酶的使用场景。然而，能在如此苛刻的条件下发挥作用蛋白酶类型非常有限。
[0004]Pepsin是最常用的HDX
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MS酸性蛋白水解酶。在典型的HDX
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MS实验条件下，pepsin最主要的酶切位点(P1位)为Met、Leu及Phe；而当His、Lys、Arg或Pro占据P1位时，则抑制pepsin酶活性。因此pepsin对于无序蛋白质或蛋白结构的无序区域(通常含有Pro及带电荷的氨基酸)不能充分酶切，从而影响对蛋白质生物学功能具有重要调节的无序蛋白或区域结构信息的获取。此外，Pepsin酶切产生的肽段平均长度在～14个氨基酸水平，肽段平均长度的降低有利于提高HDX
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MS方法的结构分辨率。基于此，开发适用于HDX
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MS实验的酸性蛋白水解酶是一项非常重要的课题。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种可以用于HDX
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MS分析下酸性蛋白水解酶，该酸性蛋白酶为来自大孢子黑曲霉(Aspergillus niger var.macrosporus)的Aspergilloglutamic肽酶(AGP)，属于天冬氨酸不敏感型酸性肽链内切酶。
[0006]本申请提供了一种制备酸性蛋白酶AGP的方法，包括：将目的基因SEQ.ID.NO.1接入表达载体中，构建重组质粒；将所述重组质粒转化到感受态细胞之后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达；从诱导表达的蛋白中纯化得到酸性蛋白酶AGP。
[0007]在一些实施例中，所述诱导表达的条件为：重组表达宿主菌37℃振摇培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷，37℃振摇培养4h。
[0008]在一些实施例中，纯化得到酸性蛋白酶AGP的纯化条件为：依次用咪唑含量为0mM、10mM、30mM各洗脱4次，洗去杂蛋白后，用咪唑含量为300mM的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。
[0009]本申请还提供了通过上述方法得到的酸性蛋白酶AGP。
[0010]本申请还提供了酸性蛋白水解酶AGP在HDX
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MS和蛋白质组学中的应用。
[0011]本申请的酸性蛋白水解酶AGP具有以下特点：在酸性条件(pH 2.5)和低温、少量变性剂和还原剂存在条件下依然保持比较强的活性；具有广泛的酶切位点，主要酶切位点为天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)等，与Pepsin酶切位点具有高度互补性；AGP酶切时产生的肽段长度比Pepsin产生的肽段更短等优点。
附图说明
[0012]图1示出了表达纯化后的蛋白酶AGP的SDS
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PAGE和Western Blot图。
[0013]图2示出了蛋白酶AGP在不同pH、温度、变性剂和还原剂条件下酶切标准肽段的活性。
[0014]图3示出了酶切标准蛋白质混合物时，来自蛋白酶AGP和Pepsin的酶切肽段重叠情况。
[0015]图4示出了酶切标准蛋白质混合物时，来自蛋白酶AGP和Pepsin的酶切肽段长度箱线图。
[0016]图5示出了酶切标准蛋白质混合物时，来自蛋白酶AGP和Pepsin的酶切肽段质量分布和箱线图。
[0017]图6示出了蛋白酶AGP和Pepsin的酶切位点比例比较柱状图。
具体实施方式
[0018]下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。
[0019]本申请提供一种酸性蛋白水解酶AGP，来自大孢子黑曲霉(Aspergillus niger var.macrosporus)。其有益效果是，该酶对带电荷的氨基酸位点的酶切具有明显偏好性，与pepsin酶切位点具有高度互补性，且产生的肽段平均长度短于pepsin，可将该酶用于HDX
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MS实验用于蛋白质结构分析以及蛋白组学分析。
[0020]本专利技术提供的酸性蛋白水解酶AGP来自重组表达。
[0021]1、AGP的表达步骤
[0022]将目的基因SEQ.ID.NO.1(SEQ.ID.NO.1的基因序列为：Atgggtcaccatcaccatcaccatatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatc
agacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggccaaG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备酸性蛋白酶AGP的方法，其特征在于，包括：将目的基因SEQ.ID.NO.1接入表达载体中，构建重组质粒；将所述重组质粒转化到感受态细胞之后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达；从诱导表达的蛋白中纯化得到酸性蛋白酶AGP。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：重组表达宿主菌37℃振摇培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷，37℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：李惠琳，张颖，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：