一种耐酸差向异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸差向异构酶突变体及其应用

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[0001]本专利技术属于酶突变体构建及应用领域，具体涉及一种D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶(DAE)的耐酸突变体及其应用。

技术介绍
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[0002]D
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阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种具有广泛生理功能的顺式己醛糖，是果糖C3位差向异构体。D
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阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70％，但其热值仅为蔗糖的0.3％，是很理想的低热量蔗糖替代物。此外，D
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阿洛酮糖能够抑制D
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葡萄糖和D
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果糖的吸收，提高胰岛素敏感性，进而减少体内脂肪的堆积。D
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阿洛酮糖还可以通过增加脂肪的氧化，同时减少碳水化合物的氧化来减轻脂肪量，因此，D
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阿洛酮糖可以有效地预防肥胖症和Ⅱ型糖尿病。与此同时，D
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阿洛酮糖可以抑制前炎性细胞活性，因此具有抗炎的作用，还具有清除活性氧能力以及通过提高细胞内谷胱甘肽含量保护神经的作用。
[0003]目前D
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阿洛酮糖的生物合成路径主要有三条，(1)经D
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阿洛酮糖3差向异构酶酶催化D
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果糖得到D
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阿洛酮糖；(2)经葡萄糖异构酶(GI)催化D
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葡萄糖为D
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果糖，D
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果糖再经路径；(3)经氧化还原酶催化阿洛醇得到D
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阿洛酮糖。目前，生物合成D
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阿洛酮糖主要是由D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶催化D
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果糖得到。Kim等在根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens str.C58)中发现一种可特异性催化D
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果糖转化为D
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阿洛酮糖的酶，转化率达到32.9％。Zhu等利用异源表达具有组合突变体DAE酶的枯草芽孢杆菌工程菌株作为生物催化剂，以750g/L D
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果糖为底物，60℃反应可得到262.5g/L D
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阿洛酮糖，转化率达到35％。
[0004]然而大多数D
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阿洛酮糖酮
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差向异构酶的最适pH范围为7.0
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9.0(偏碱性)，而制糖工业的生产是在偏酸性的条件下进行，因为在中性或弱碱性条件下，D
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阿洛酮糖的羟基倾向于与氨基相互作用，导致非酶褐变反应加剧，糖液颜色加深，从而降低产品纯度，增加分离难度。然而，D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶在低pH值下会很快失活，无法在酸性条件下使用。因此，随着D
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阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，提高D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶的酸稳定性对于解决工业D
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阿洛酮糖制造问题至关重要。

技术实现思路
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[0005]本专利技术技术方案如下：
[0006]本专利技术提供了一种D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶的耐酸突变体I114R，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，以来源于纤维素梭菌H10的D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.ACL75304)为亲本，通过定点突变技术将其活性催化中心的第114位的氨基酸残基由异亮酸突变成精氨酸所得。
[0007]进一步地，本专利技术提供编码上述D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶耐酸突变体I114R的基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]进一步地，本专利技术提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ IDNO:1所示的基因序列。
[0009]优选地，所述重组表达载体为pPIC9k、pMA5或pET载体。
[0010]进一步地，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体。
[0011]优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。
[0012]进一步地，本专利技术提供一种包含上述耐酸突变体酶基因序列(SEQ ID NO:1所示)的重组表达载体的构建方法，具体包括如下步骤：
[0013]1)将来源于纤维素梭菌的野生型D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因序列合成连接至表达载体上，得到含有野生型D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因的重组表达载体；上述用于连接野生型D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因序列的表达载体为pET22b、pPIC9k或pMA5载体；
[0014]2)以步骤1)构建的重组表达载体为模板，设计定点突变引物I114R
‑
F和I114R
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R进行定点突变PCR扩增反应；反应后的PCR产物用DpnI酶消化1h后再进行环化；所述定点突变引物I114R
‑
F和I114R
‑
R的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0015]3)取微量环化产物，采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，复苏培养后再涂平板过夜培养；待长出转化子后，挑取转化子置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD
600
达到2.0～3.0后提质粒进行测序验证，测序验证正确的质粒即为包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体。
[0016]进一步地，本专利技术提供一种利用上述包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体构建可表达耐酸突变体酶的工程菌株的方法，其特征在于：将所述包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体通过热激转化法转入宿主菌感受态细胞中，复苏培养后再涂平板过夜培养；待长出转化子后，挑取转化子于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min培养6～8h后再转瓶扩大培养，获得工程菌株。
[0017]进一步地，上述步骤中用于热激法转入重组表达载体的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。
[0018]进一步地，本专利技术提供一种利用上述工程菌株制备耐酸突变体酶的方法，包括如下步骤：
[0019]1)将所述工程菌株在液体培养基中扩大培养至菌液浓度OD
600
达到0.6～0.8，之后加入终浓度为0.5mM的IPTG，于16℃，120rpm/min诱导培养16h；
[0020]2)诱导培养后，将菌液离心收集菌体，菌体用Lysis Buffer重悬后加入终浓度为200μg/mL的溶菌酶和终浓度为120μg/mL的PMSF，搅拌重悬20min；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶的耐酸突变体I114R，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种编码权利要求1所述的D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶的耐酸突变体I114R的基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:1所示的基因序列。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pPIC9k、pMA5或pET载体。5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达载体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。7.一种包含权利要求2所述的耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)将来源于纤维素梭菌的野生型D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因序列合成连接至表达载体上，得到含有野生型D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因的重组表达载体；其中，用于连接野生型D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因序列的表达载体为pET22b、pPIC9k或pMA5载体；2)以步骤1)构建的重组表达载体为模板，设计定点突变引物I114R
‑
F和I114R
‑
R进行定点突变PCR扩增反应；反应后的PCR产物用DpnI酶消化1h后再进行环化；其中，所述定点突变引物I114R
‑
F和I114R
‑
R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；3)取微量环化产物，采用热激法转化至...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦慧民，路福平，王树森，孙肖旋，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：