一种不可逆合成燕窝酸的微生物细胞转化方法技术

本发明专利技术公开了一种不可逆合成燕窝酸的多酶催化体系及其全细胞转化方法，属于合成生物学领域、食品加工和生物医药制备技术领域。本发明专利技术通过三种定向进化后优选的酶组合，构建了以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物单元不可逆合成燕窝酸的一种多酶催化途径；利用该酶组合与辅因子再生系统的偶联，体外酶催化得到20.2g/L燕窝酸，底物转化率65％。在此基础上采用食品安全菌种为底盘菌，将所述酶催化途径的基因整合到表达载体或基因组中进行过表达，同时构建dCas9/CRISPRi系统，定向调节底物竞争途径对燕窝酸合成前体的消耗，所得到的全细胞在5L发酵罐中燕窝酸最高产量为～160g/L，底物转化率超过60％，展现了巨大的工业生产价值。展现了巨大的工业生产价值。展现了巨大的工业生产价值。

【技术实现步骤摘要】
一种不可逆合成燕窝酸的微生物细胞转化方法


[0001]本专利技术涉及一种高效合成燕窝酸的微生物细胞转化方法，属于合成生物学领域和食品加工


技术介绍

[0002]燕窝酸又称唾液酸(sialicacid,SA)，是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。其中最常见和代表性的燕窝酸分子是5
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氨基
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3,5
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二脱氧
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D
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甘油
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D
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半乳壬酮糖(N
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acetyl
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D
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neuraminicacid,Neu5Ac)，学名叫作“N
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乙酰基神经氨酸”。燕窝酸Neu5Ac是细胞膜糖蛋白和糖脂的重要组成部分，积极参与体内蛋白水解保护、细胞识别、生殖、感染、免疫和认知发育等生物学作用。最新研究表明SA具有多样的生物学功能(例如：抗粘附、抗肿瘤、抗病毒、提高婴儿记忆力等等)，被美国、欧盟和中国批准为新型食品原料，使其在食品、医药等方面的需求日益增加。
[0003]唾液酸的生产方法主要包括化学合成法、酶合成法、天然原料提取法、多聚物分解法和微生物发酵法。唾液酸的生产方法主要包括化学合成法、酶合成法、天然原料提取法、多聚物分解法和微生物发酵法。由于此方法需要铟等有毒金属作为催化剂，化学合成时的条件也较为苛刻，再加上产物回收率低，难以广泛应用。某些大肠杆菌能够在特定的培养基中产生多聚神经氨酸。通过发酵法获得多聚神经氨酸，又经神经氨酸酶水解得到高纯度的燕窝酸。然而，由于此方法产量低、成本高，不适合唾液酸的大规模生产。
[0004]通过收集基因工程改造的微生物细胞直接以乙酰基氨糖(GlcNAc)和丙酮酸(Pyruvate)为底物催化合成燕窝酸，此方法不仅简化了工艺操作、降低了酶的纯化成本，又可以将细胞多次循环利用。目前，全细胞转化方法仍然存在关键酶元件缺乏、催化途径可逆、多酶催化速率不协调等缺陷，限制了绿色生物制造背景下的燕窝酸规模化生产和工业应用。

技术实现思路

[0005]全细胞转化实质上就是利用菌体内的酶作为催化剂，将底物转化成产物的过程，由于其过程简便、反应条件温和、副产物少和产率高的优势。近年来有大量的研究集中于全细胞转化来生产以Neu5Ac为代表的燕窝酸。该转化法主要涉及两种底物(乙酰基氨糖和丙酮酸)和四种酶元件(乙酰基氨糖差向异构酶AGE、磷酸烯醇丙酮酸合成酶PpsA、N
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乙酰神经氨酸合成酶NeuB、多聚磷酸盐激酶PPK)，通过三步途径转化就可以合成燕窝酸Neu5Ac。因此，在微生物胞内整合上述途径来合成高附加值燕窝酸，是一种低污染、低能耗、高效率的全细胞转化技术。
[0006]本专利技术以乙酰基氨糖(GlcNAc)和丙酮酸(Pyruvate)为底物，利用微生物资源及其数据库，挖掘了新型的酶元件，组装了高效、不可逆的三步法燕窝酸(Neu5Ac)合成途径；再通过酶分子理性改造，强化了酶元件在合成途径中的正向反应速率，提升Neu5Ac积累量；接着通过基因工程策略理性设计了AGE、PpsA、NeuB三种酶在胞内外的空间差异分布，实现了
酶元件与细胞的定向自组装，增强了丙酮酸的正向转化，提升了燕窝酸产物得率；最后，对全细胞转化体系进行了全面优化，从而为获得了以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物高效合成燕窝酸的全细胞转化体系。本专利技术的目的在于提供一种燕窝酸合成的新型酶元件、酶
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细胞组装方式、全细胞转化工程菌及其转化体系和方法。
[0007]本专利技术的首先提供一种以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物合成燕窝酸的不可逆酶催化体系，所述不可逆酶催化体系，主要包括乙酰基氨糖差向异构酶AGE、磷酸烯醇丙酮酸合成酶PpsA、N
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乙酰神经氨酸合成酶NeuB。
[0008]在一种实施方式中，所述乙酰基氨糖差向异构酶AGE最初基因来源于Synechocystis sp.PCC 6803(NCBI Reference Sequence:WP_010872280.1)；所述磷酸烯醇丙酮酸合成酶PpsA最初基因来源于Escherichia coli MG 1655(NCBI Reference Sequence:NP_416217.1；所述N
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乙酰神经氨酸合成酶NeuB最初基因来源于Moritella viscosa(NCBI Reference Sequence:WP_075481117)。
[0009]在一种实施方式中，用于酶催化合成燕窝酸的AGE、PpsA和NeuB三种酶的基因是经过定向进化而得到。不但核苷酸序列具有独特性，而且以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物，经过三步反应，转化合成燕窝酸。
[0010]在一种实施方式中，AGE的氨基酸序列，在WP_010872280.1所示氨基酸序列的基础上发了突变，第81位的氨基酸Tyr突变成了Ala，或者是第202位的Ile突变成了Asp且第397位的Glu突变成了Gln，或者是同时将第81位的氨基酸突变成了Ala且第202位突变成了Asp且第397位突变成了Gln。
[0011]在一种实施方式中，PpsA的氨基酸序列，在NP_416217.1所示氨基酸序列的基础上发了突变，第654位突变成了Ile，或者是第578位突变成了Lys且第711位突变成了Asn。
[0012]在一种实施方式中，NeuB的氨基酸序列，在WP_075481117所示氨基酸序列的基础上发了突变，第34位突变成了Asn，或者是第288位突变成了Ser，或者是第34位突变成了Asn且第288位突变成了Ser。
[0013]在一种实施方式中，编码所述优选的AGE的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(AGE3)。
[0014]在一种实施方式中，编码所述优选的PpsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(PpsA1)。
[0015]在一种实施方式中，编码所述优选的NeuB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(NeuB2)。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供利用所述不可逆酶催化途径合成燕窝酸的方法，所述方法是以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物，通过三种酶三步途径转化合成燕窝酸。
[0017]在一种实施方式中，所述酶催化，是直接采用酶催化体系或者全细胞转化生产体系。
[0018]在一种实施方式中，是直接采用酶催化体系。将所述乙酰基氨糖差向异构酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶、N
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乙酰神经氨酸合成酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每摩尔底物添加1000～2000U，添加比例为(1～2)：(1～2)：(1～2)(以反应体系总酶活计算)；乙酰基氨糖和丙酮酸的初始浓度在100～500mM，辅因子三磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在pH7～8的体系中30～40℃下反应。在一种实施方式中，反应时间位为12h。
[0019]优选的，乙酰基氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物合成燕窝酸的不可逆酶催化体系，其特征在于，所述不可逆酶催化方法，主要包括乙酰基氨糖差向异构酶AGE、磷酸烯醇丙酮酸合成酶PpsA、N
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乙酰神经氨酸合成酶NeuB。2.根据权利要求1所述的酶催化体系，其特征在于，所述乙酰基氨糖差向异构酶AGE来源于Synechocystis sp.PCC 6803；或者，所述AGE的氨基酸序列，在WP_010872280.1所示氨基酸序列的基础上发了突变，将第81位的氨基酸Tyr突变成了Ala，或第202位的Ile突变成了Asp且第397位的Glu突变成了Gln，或同时将第81位的氨基酸突变成了Ala且第202位突变成了Asp且第397位突变成了Gln；所述磷酸烯醇丙酮酸合成酶PpsA来源于Escherichia coli MG1655；或者，所述PpsA的氨基酸序列，在NP_416217.1所示氨基酸序列的基础上发了突变，将第654位突变成了Ile，或者是第578位突变成了Lys且第711位突变成了Asn；所述N
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乙酰神经氨酸合成酶NeuB来源于Moritella viscosa；或者，所述NeuB的氨基酸序列，在WP_075481117所示氨基酸序列的基础上发了突变，第34位突变成了Asn，或者是第288位突变成了Ser，或者是第34位突变成了Asn且第288位突变成了Ser。3.根据权利要求1所述的酶催化体系，其特征在于，编码所述AGE的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述PpsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述NeuB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1
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3任一所述的酶催化体系，其特征在于，是以乙酰基氨糖和丙酮酸为底物，通过三种酶三步途径转化合成燕窝酸；所述酶催化体系，是直接采用酶催化体系或者全细胞转化生产体系。5.根据权利要求4所述的酶催化体系，其特征在于，是直接采用酶催化体系；将所述乙酰基氨糖差向异构酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶、N
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乙酰神经氨酸合成酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每摩尔底物添加1000～2000U，添加比例为(1～2)：(1～2)：(1～2)；乙酰基氨糖和丙酮酸的初始浓度在100～500mM，辅因子三磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在pH 7～8的体系中30～40℃下反应。6.一种转化生产燕窝酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了AGE、PpsA和NeuB三种酶基因；其中，所述乙酰基氨糖差向异构酶AGE来源于Synechocystis sp.PCC 6803；或者，所述AGE的氨基酸序列，在WP_010...

【专利技术属性】
技术研发人员：方真，丁春华，沙冲，章文劼，
申请(专利权)人：江苏海飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：