同步制备D-阿洛酮糖和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及其应用技术

技术编号:37566796 阅读:19 留言:0更新日期:2023-05-15 07:46
本发明专利技术涉及微生物发酵领域,公开了一种同步制备D

【技术实现步骤摘要】
同步制备D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵领域,具体涉及一种同步制备D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的方法及其应用。

技术介绍

[0002]D

阿洛酮糖是D

果糖在C

3位的差向异构体,属于自然界中存在量较少的稀有单糖。阿洛酮糖的口感与蔗糖类似,且加工和质构性能等也与蔗糖相差无几。近年来不断有研究表明,阿洛酮糖在抗氧化、控制血糖水平、预防肥胖等方面具有良好的效果,是最具潜力的蔗糖替代品之一。
[0003]然而,D

阿洛酮糖的化学合成较为困难,过程中副产品较多,而且对于食品而言,化学合成生产的安全性也难以保证。因此,目前D

阿洛酮糖主要采用生物转化的方式进行制备,先收集由微生物表达载体分泌的D

阿洛酮糖3

差向异构酶(DPEase),然后再利用DPEase催化转化D

果糖获得D

阿洛酮糖。因此,对DPEase高效表达的研究是目前阿洛酮糖生产过程中研究热点。例如,江南大学建立了不同梭菌来源的DPEase菌株,并对菌株构建和表达出的酶的催化效果进行了深入研究。然而,这种先进行DPEase生产,再进行D

阿洛酮糖转化的生产工艺较长,其中还涉及到酶的保存、分装和运输等过程,对整个生产链的条件要求较高。而且,虽然目前已经有研究者开发出能够异源表达DPEase的工程菌菌株,但是在生产中的表达效率或酶的活力方面尚不理想。此外,现有工程菌培养过程中一般采用的都是常规市售培养基,大批量生产的成本较高,不利于规模化和产业化推广。
[0004]实现阿洛酮糖的一步转化是解决上述工艺过程长问题的有效途径之一。例如,中国科学院天津工业生物技术研究所开发了插入瘤胃球菌属来源的DPEase基因的枯草芽孢杆菌异源表达体系,并通过对其进行全通路代谢工程改造,形成了D

阿洛酮糖直接合成的工艺。然而,该方法中使用的菌株的稳定性尚有待考证,生产性能也有待提高,且培养成本问题仍未得到解决。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的阿洛酮糖生产过程中DPEase表达效率或酶活力不理想,酶液保存和运输难度大,且生产成本高、工艺流程长、对产业链要求高等问题,提供一种同步制备D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的方法及其应用。本专利技术提供的方法具有生产周期短,生产过程易于控制,D

阿洛酮糖3

差向异构酶表达高效等优点。
[0006]为了实现上述目的,本专利技术一方面提供一种制备D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的方法,所述方法包括将工程菌接种至培养基中进行培养,获得含有D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的培养液,其中,所述培养基中的碳源既提供工程菌生长代谢所需的糖类物质,同时也提供可供D

阿洛酮糖3

差向异构酶进行酶促反应获得D

阿洛酮糖的
酶促反应底物。
[0007]本专利技术第二方面提供如上所述的方法制备获得的D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶。
[0008]本专利技术第三方面提供如上所述的方法在工业化D

阿洛酮糖和/或D

阿洛酮糖3

差向异构酶生产中的应用。
[0009]通过上述技术方案,本专利技术能够取得如下有益效果:
[0010](1)本专利技术提供的方法中,采用的培养基成分同时对工程菌给予养分支持并为D

阿洛酮糖的酶促转化提供底物,实现了D

阿洛酮糖3

差向异构酶和D

阿洛酮糖的“一锅生产”。
[0011](2)本专利技术的优选工程菌菌株能够利用糖蜜中的部分成分(蔗糖和葡萄糖等还原糖)生长并高效表达D

阿洛酮糖3

差向异构酶,而糖蜜中的果糖成分能够作为D

阿洛酮糖的生产原料,由该菌株表达的DPEase转化为D

阿洛酮糖,在实现D

阿洛酮糖3

差向异构酶和D

阿洛酮糖“一锅生产”的基础上,提高了原料的利用率,降低了原料成本,简化了生物转化法生产阿洛酮糖和DPEase的培养基配制过程,一步实现糖蜜中有效成分的高值化转化。而且,糖蜜来源广泛且价格低廉,以其为主要原料极大降低了生产成本,同时还合理利用了制糖产业副产品,完善了产业结构,十分适合规模化推广应用。
[0012](3)本专利技术提供的优选方法中,通过对培养温度的控制将培养过程分为生长和表达两个阶段,兼顾了工程菌的生长和产酶效率,生产周期较短。同时,还通过对整个培养过程中的条件进行调控,使得D

阿洛酮糖3

差向异构酶的表达更加高效。
[0013](4)本专利技术提供的优选方法中,根据培养体系中的pH值和溶氧量变化来实施和调控补料,相比于目前最常用的以还原糖等原料残留量为依据的方式而言,能够实现“低频取样、精准检测”的目的,简化了生产过程中的控制和管理流程,更便于实现工业化生产。
具体实施方式
[0014]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0015]本专利技术中,“DPEase”为“D

阿洛酮糖3

差向异构酶”的简写形式,其二者意义相同,可以互换使用。
[0016]本专利技术中,未作特殊说明的情况下,所述“果糖”均指D

果糖,所述“阿洛酮糖”均指D

阿洛酮糖。
[0017]本专利技术中,“糖蜜”是指制糖工业的副产品,即制糖过程中,经过多次重复浓缩和结晶糖分离的处理后,无法再进行浓缩结晶的残留粘稠液体,在工业上又称为“废糖蜜”。通常呈褐色、棕褐色或黑褐色。根据原料的不同可以具体分为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等多个种类。未作特殊说明的情况下,“糖蜜”和“废糖蜜”意义相同,可以互换使用。
[0018]本专利技术中,没有特别指明的本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同步制备D

阿洛酮糖和D

阿洛酮糖3

差向异构酶的方法,其特征在于,所述方法包括将工程菌接种至培养基中进行培养,获得培养液,其中,所述培养基中的碳源既提供工程菌生长代谢所需的糖类物质,同时也提供可供D

阿洛酮糖3

差向异构酶进行酶促反应获得D

阿洛酮糖的酶促反应底物。2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述培养基包含碳源、氮源、无机盐和水,优选所述碳源中含有果糖和工程菌生长代谢所需的糖类物质,更优选在所述培养基中,由所述碳源中的糖类物质提供的C元素含量为4

16g/L;优选地,所述碳源为蔗糖和/或葡萄糖与果糖的混合物;优选地,所述碳源为糖蜜;优选地,所述氮源的含量以N元素计为2

5g/L;优选地,所述无机盐用于提供K、P、S和Mg中的至少一种;更优选地,所述糖蜜中含有总糖45

55重量%,粗蛋白2

3重量%,可溶性胶体3

10重量%,灰分10

15重量%,矿物质3

10重量%,生物素2.5

3.5重量

;更优选地,所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、玉米浆、棉籽蛋白、鱼膏和豆粕水解液中的至少一种;更优选地,在所述培养基中,所述无机盐提供K 5.5

8g/L,P 3

5g/L,S 0.3

0.8g/L,Mg 0.1

0.3g/L;更优选地,所述无机盐包括K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4和MgSO4中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述工程菌选自基因工程改造的芽孢杆菌,优选为基因工程改造的枯草芽孢杆菌;优选地,所述枯草芽孢杆菌中含有SEQ ID NO:1所示的序列;更优选地,所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌1012。4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述培养的方式包括将所述工程菌接种至培养基中后,在生长培养条件下进行生长培养,而后在表达培养条件下进行表达培养;优选地,所述工程菌的接种量使得生长培养体系中,所述工程菌的初始OD
600
值达到0.05

0.5;优选地,所述生长培养条件包括:温度35

37℃,pH 6.9

7.1,初始搅拌速率使得搅拌桨尖线速度为40

【专利技术属性】
技术研发人员:佟毅周卫强王琪彭超郭元亨李凡李义武丽达梁颖超王亮
申请(专利权)人:中粮营养健康研究院有限公司
类型:发明
国别省市:

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