一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽制造技术

本发明专利技术提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1‑4。本发明专利技术再一个方面提供一种海豚链球菌PDHA1多表位疫苗，其中抗原为上述的多表位多肽。本发明专利技术所制备的PDHA1多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且保护效果明显好于PDHA1重组亚单位疫苗以及S.iniae全菌灭活疫苗。

A PDHA1 multi epitope polypeptide of Paralichthys olivaceus

【技术实现步骤摘要】
一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽
本专利技术属于免疫抗原制备
，具体涉及一种牙鲆海豚链球菌(Streptococcusiniae)丙酮酸脱氢酶E1α亚单位(PDHA1)的多表位多肽，及该多表位多肽在制备疫苗中的应用。
技术介绍
海豚链球菌(S.iniae)是一种革兰氏阳性菌，呈卵圆形，菌体直径约1.5μm，有荚膜，链状排列，属链球菌科链球菌属(Streptococcus)。海豚链球菌广泛分布于海淡水环境中，可感染多种海淡水养殖鱼类如牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、真鲷(Chrysophrysmajor)、罗非鱼(Oreochromisnilotica)等，给水产养殖业造成重大的经济损失。海豚链球菌也可感染人类，引起细菌性蜂窝织炎、脑膜炎、心内膜炎和感染性关节炎。使用抗生素及化学药物可防止海豚链球菌病的暴发，但是容易产生耐药菌株，造成药物残留影响水产品的质量安全，同时也会污染水环境。相对于药物防治，疫苗接种被普遍认为是一种控制鱼类病害的有效方法，具有安全、环保的优点，能为鱼体提供有效的保护。目前，已有海豚链球菌福尔马林灭活疫苗、改良活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗的研究资料，但尚无关于海豚链球菌表位疫苗的报道。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenicdeterminant)，它是TCR/BCR及抗体特异结合的基本单位。表位可分为连续表位(线性表位)和不连续表位(构象表位)，在免疫应答中，根据抗原表位所识别的TCR和BCR不同，分为T细胞表位和B细胞表位。B细胞表位分为线性表位和构象表位，表位大小一般不超过20个氨基酸，能被机体识别且能够刺激机体产生抗体，是蛋白质抗原性的基础，也是诱导机体产生免疫应答的基本结构。自然发生的免疫反应不能识别所有的表位，而是集中于相对较少的表位。由于表位在疫苗设计、疾病预防、诊断和治疗等方面具有巨大的潜力，因此，表位的研究成为热点。表位疫苗是以抗原表位为基础制备的新型疫苗，相较于传统疫苗，避免了完全抗原中其它不利表位的副作用，提高了安全性，代表未来疫苗的研制方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，并使用该多表位多肽来制备疫苗；从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQIDNO:1-4；所述的多肽接头，其氨基酸序列为GGGG、EAAAK、AAY、GPGPG；更优选的，所述的多肽接头为KK；作为优选，所述的牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽的一种具体氨基酸序列为SEQIDNO:5；编码上述多表位多肽的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:6；本专利技术还提供一种重组工程菌株，用于重组表达上述的多表位多肽。本专利技术再一个方面提供一种海豚链球菌PDHA1多表位疫苗，其中抗原为上述的多表位多肽。本专利技术所制备的PDHA1多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且保护效果明显好于PDHA1重组亚单位疫苗以及S.iniae全菌灭活疫苗。附图说明图1：海豚链球菌PDHA1蛋白的二级结构分析图；图2：海豚链球菌PDHA1蛋白分子三级结构模型；图3：ELISA检测合成肽与牙鲆血清抗体的反应，其中A为PDHA1抗原表位多肽与牙鲆抗PDHA1血清结合反应；B为表位多肽与牙鲆抗海豚链球菌血清结合反应；图4：模拟表位串联肽MEPIP的亲水性、抗原性及表面可及性预测图；图5：多表位多肽rMEPIP反应原性鉴定，其中M：分子量标准蛋白；1：阴性对照，未加诱导剂的表达菌；2：加入诱导剂的表达菌；3：纯化后的蛋白；4：重组蛋白与牙鲆抗S.iniae血清反应；5：阴性对照；图6：海豚链球菌攻毒后FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS组牙鲆的相对免疫保护率；图7：免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后牙鲆外周血、头肾CD4-1+/CD4-2+/CD8β+T淋巴细胞比例变化柱状图，其中A/A1：各组外周血、头肾中CD4-1+T淋巴细胞比例变化柱状图；B/B1：各组外周血、头肾中CD4-2+T淋巴细胞比例变化柱状图；C/C1：各组外周血、头肾中CD8β+T淋巴细胞比例变化柱状图；图8：免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后牙鲆外周血(A)、脾脏(B)、头肾(C)sIgM+淋巴细胞比例变化柱状图；图9：ELISA测定免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后1-7w牙鲆血清中总抗体水平的变化柱状图(A)，以及抗海豚链球菌特异性抗体水平的变化柱状图(B)。具体实施方式本专利技术提供的海豚链球菌PDHA1蛋白的B细胞串联多表位多肽分子结构序列，通过分析获得的抗原表位的连接顺序和间隔序列，确定以KK接头的连接顺序为最佳串联方式，设计获得各表位间相对独立，抗原参数好的海豚链球菌PDHA1多表位串联序列。下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本专利技术。实施例1：生物信息学方法分析PDHA1蛋白的B细胞线性抗原表位1、预测抗原表位1)以海豚链球菌PDHA1蛋白氨基酸序列(WP_003099247.1)为分析材料，利用SOPMAServer对海豚链球菌PDHA1蛋白的二级结构进行预测。结果显示，PDHA1基因中无规则卷曲占25.78％，β-转角为13.04％。α-螺旋和延伸链即β-折叠分别占45.65％和15.53％，各种结构在海豚链球菌PDHA1蛋白氨基酸序列中的分布情况见图1。2)应用DNAStarProtean生物信息学软件及在线网站(IEDB:http://tools.iedb.org/main/bcell/andProtScale:http://us.expasy.org/)分析蛋白二级结构中的柔性区域和可塑性区域，预测氨基酸的亲水性(HydrophilicityPlot-Kyte-Doolittle)、柔韧性(FlexibleRegions-Karplus-Schulz)、抗原性(AntigenicIndex-Jameson-Wolf)和表面可及性(SurfaceProbabilityPlot-Emini)，通过综合各个软件和网站分析上述多参数预测结果，取位于β-转角和无规则卷曲区域，以及亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为可能的蛋白B细胞线性表位。经分析预测获得5条PDHA1蛋白的B细胞线性表位，详细见表1。表1：海豚链球菌PDHA1蛋白的B细胞线性抗原表位预测表(3)用PyMOL明确优势表位在蛋白三维结构中的位置，结果显示P1、P2、P4、P5肽段序列大部分位于蛋白结构表面，而P3肽段序列则位于蛋白结构内面(图2)。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，其特征在于，所述的多表位多肽包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-4。/n

【技术特征摘要】
1.一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，其特征在于，所述的多表位多肽包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQIDNO:1-4。


2.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是氨基酸序列为GGGG、EAAAK、AAY、GPGPG的多肽接头。


3.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是氨基酸序列为KK的多肽接头。


4.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多表位多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:5。


5.一种基因，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：绳秀珍，刘敏，战文斌，唐小千，邢婧，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37