突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶、其编码核酸以及应用制造技术

本发明专利技术涉及突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白、其生物活性片段以及包含编码所述蛋白或片段的核酸序列的分离的多核苷酸，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段保留或加强了其催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性明显低于野生型HPPD。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和宿主细胞，以及生产具有催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质、同时对HPPD抑制性除草剂的敏感性明显降低的植物的方法。

Mutant p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, its coding nucleic acid and its application

【技术实现步骤摘要】
突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶、其编码核酸以及应用
本专利技术属于农业基因工程领域，具体涉及向植物赋予HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的新型突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)、其编码核酸以及应用。
技术介绍
对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)是催化羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸盐的反应的酶。这个反应在酶结合的铁和氧的存在下发生。通过抑制HPPD而起作用的除草剂是熟知的，包括多种类型，比如异噁唑类、二酮腈类、三酮类以及吡唑啉盐类等。对HPPD的抑制作用阻断了从酪氨酸生物合成质体醌(PQ)。PQ在类胡萝卜素色素的生物合成中是一种必需的辅因子，这些类胡萝卜素色素对于光合中心的光防护是必需的。抑制HPPD的除草剂是通过韧皮部可移动的漂白剂，它们引起暴露于光的新的分生组织和叶子显现出白色。在缺乏类胡萝卜素下，叶绿素是光破坏性的并且通过单线态氧的光敏作用而自身变成一种光化裂解剂。用于提供耐受HPPD抑制性除草剂的植物的技术路线与方法同样是已知的，包括将HPPD酶过量表达从而在植物中产生大量的HPPD酶，这些HPPD酶与一种给定的除草剂是充分相关的从而具有足够的可供使用的功能性酶(尽管存在它的抑制剂)，或者是将目标HPPD酶突变成一种功能性的、但是对于除草剂更加不敏感的HPPD。HPPD抑制性除草剂是一个大类，它涵盖了许多不同类型。虽然一种给定的突变体HPPD酶可以提供对于一种或一些HPPD抑制性除草剂的一个有用水平的耐受性，但同一或单一突变体HPPD可能不足以提供对于另一种或另一类不同的、更希望的HPPD抑制性除草剂的商业水平的耐受性(参见例如美国申请公开号2004/0058427；以及PCT申请公开号WO98/20144和WO02/46387；还参见美国申请公开号2005/0246800，它涉及作为相对耐受HPPD的大豆品种的鉴定和标记)。而且，不同HPPD抑制性除草剂可以在它们控制的杂草范围、使用的作物对象、制造成本以及环境益处方面是不同的。因此，本领域中仍然需要用于向不同的作物和作物品种赋予对HPPD抑制性除草剂的抗性/耐受性的新型突变HPPD。在创制除草剂耐受性作物和作物品种方面，转基因技术已广泛应用。但是，转基因作物的应用一直受到登记成本高的限制。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术进步可以改变这一现状。CRISPR/Cas9是2012年以来出现的新基因定点编辑技术(Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,andCharpentier,E.2012.Aprogrammabledual-RNA–guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science.337:816–821.；Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,andZhang,F.2013.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science.339:819–823；Li,J.F.,Norville,J.E.,Aach,J.,Mccormack,M.,Zhang,D.,Bush,J.,Church,G.M.,andSheen,J.2013.Multiplexandhomologousrecombination-mediatedgenomeeditinginArabidopsisandNicotianabenthamianausingguideRNAandCas9.Nat.Biotechnol.31:688.；Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,Dicarlo,J.E.,Norville,J.E.,andChurch,G.M.2013.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.339:823.)。CRISPR/Cas9系统对编辑靶点的识别是依靠核酸分子之间的碱基互补配对，可对任何紧跟PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑。另外，CRISPR/Cas9系统操作简单，每次打靶只需替换原有载体上的20-30bp的靶向核苷酸序列，适宜高通量操作。可以同时编辑同一基因的多个位点以及多个不同的基因。目前，这项技术在生物医学、功能基因组学、动植物性状改良和新性状的创制等方面已显现出巨大的应用前景，正在对动植物育种产生革命性的促进作用(HuiZhang，JinshanZhang,ZhaoboLang,JoseRamonBotellad,andJian-KangZhu.2017.GenomeEditing—PrinciplesandApplicationsforFunctionalGenomicsResearchandCropImprovement,CriticalReviewsinPlantSciences,36:4,291-309,DOI:10.1080/07352689.2017.1402989).CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑工具，主要是通过三种方式来实现定点编辑的。第一种是基因的定点敲除获得突变体。具体讲，Cas9在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。定点敲除的效率都较高。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑(KomorAC,KimYB,PackerMS,ZurisJA,LiuDR.ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble-strandedDNAcleavage.Nature.2016May19；533(7603):420-4.doi:10.1038/nature17946；GaudelliNM,KomorAC,ReesHA,PackerMS,BadranAH,BrysonDI,LiuDR.ProgrammablebaseeditingofA·TtoG·CingenomicDNAwithoutDNAcleavage.Nature.2017Nov23；551(7681):464-471.doi:10.1038/nature24644.Epub2017Oct25.Erratumin:Nature.2018May2)。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas9系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。如：YanF.,KuangY.,RenB.,WangJ.,ZhangD.,LinH.,YangB.,Zho本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白的氨基酸序列与野生型水稻对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID NO:2所示的野生型水稻对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白氨基酸序列中的第93、103、141、165、191、220、226、276、277、336、337、338、342、346、370、377、386、390、392、403、410、418、419、420、430和431位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：93S、103S、141R、141K、141T、165V、191I、220K、226H、276W、277N、336D、337A、338D、338S、338Y、342D、346C、346D、346H、346S、346Y、370N、377C、386T、390I、392L、403G、410I、418P、419F、419L、419V、420S、420T、430G和431L。/n

【技术特征摘要】
20180604 CN 201810565916X1.一种突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白的氨基酸序列与野生型水稻对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQIDNO:2所示的野生型水稻对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白氨基酸序列中的第93、103、141、165、191、220、226、276、277、336、337、338、342、346、370、377、386、390、392、403、410、418、419、420、430和431位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：93S、103S、141R、141K、141T、165V、191I、220K、226H、276W、277N、336D、337A、338D、338S、338Y、342D、346C、346D、346H、346S、346Y、370N、377C、386T、390I、392L、403G、410I、418P、419F、419L、419V、420S、420T、430G和431L。


2.权利要求1所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白的氨基酸序列进一步与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。


3.权利要求1所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，区别在于具有权利要求1中所定义的一个或多个氨基酸突变。


4.权利要求1－3中任一项所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白的氨基酸序列在对应于SEQIDNO:2所示的野生型水稻对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白氨基酸序列中的第93、103、141、165、191、220、226、276、277、336、337、338、342、346、370、377、386、390、392、403、410、418、419、420、430和431位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：R93S、A103S、H141R、H141K、H141T、A165V、V191I、R220K、G226H、L276W、P277N、P336D、P337A、N338D、N338S、N338Y、G342D、R346C、R346D、R346H、R346S、R346Y、D370N、I377C、P386T、L390I、M392L、E403G、K410I、K418P、G419F、G419L、G419V、N420S、N420T、E430G和Y431L。


5.权利要求4所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示的氨基酸序列。


6.权利要求4所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白的氨基酸序列具有如下氨基酸突变：H141R/G342D、H141R/D370N、G342D/D370N、H141R/N338D、H141R/G342D、N338D/G342D、K418P/G419F、G419F/N420S、G342D/R346C、G342D/R346H、H141R/N420S、G338D/K418P、P277N/N338D、L276W/P277N、H141R/G342D/D370N、H141R/N338D/N420S、H141R/N338S/N420S、P336D/N338D/G342D、P336D/N338S/G342D、P336D/N338Y/G342D、N338D/G342D/R346C、N338D/G342D/R346H、N338D/G342D/R346S、N338S/G342D/R346C、N338S/G342D/R346H、N338S/G342D/R346S、N338Y/G342D/R346C、N338Y/G342D/R346H、N338Y/G342D/R346S、P336D/G342D/R346C、P336D/G342D/R346H、P336D/G342D/R346S、P336D/N338D/R346C、P336D/N338D/R346H、P336D/N338D/R346S、P336D/N338S/R346C、P336D/N338S/R346H、P336D/N338S/R346S、P336D/N338Y/R346C、P336D/N338Y/R346H、P336D/N338Y/R346S、H141R/N338D/G342D、H141R/G342D/K418P、H141R/G342D/G419F、H141R/G342D/P386T、K418P/G419F/N420T、K418T/G419F/N420T、H141R/G342D/R346C、H141R/G342D/R346H、H141R/G342D/N420S、H141R/G342D/P277N、H141R/G342D/P336D、H141R/G342D/L276W、H141R/G342D/R346S、H141R/G342D/L390I、H141R/G342D/I377C、H141R/G342D/M392L、H141R/P337A/G342D、H141R/N338S/G342D、H141R/N338Y/G342D、P277N/N338D/G342D、P277N/G342D/R346C、P277N/N338D/N420S、N338D/G342D/K418P、H141R/N338D/G342D/K418P、H141R/N338D/G342D/G419F、H141R/N338D/G342D/P386T、H141R/N338D/G342D/R346C、H141R/N338D/G342D/R346H、H141R/G342D/K418P/G419F、H141R/G342D/L276W/P277N、P336D/N338D/G342D/R346C、P336D/N338D/G342D/R346H、P336D/N338D/G342D/R346S、P336D/N338S/G342D/R346C、P336D/N338S/G342D/R346H、P336D/N338S/G342D/R346S、P336D/N338Y/G342D/R346C、P336D/N338Y/G342D/R346H、P336D/N338Y/G342D/R346S、P277N/P336D/N338D/G342D、P277N/N338D/G342D/R346C、P277N/N338D/K418P/G419F、H141R/N338D/G342D/K418P/G419F、H141R/N338D/G342D/G419F/N420S、H141R/G336D/G342D/K418P/G419F/N420S、H141R/N338D/G342D/K418P/G419F/N420S、H141R/N338D/G342D/K418P/G419F/N420T、H141R/N338D/G342D/R346C/K418P/G419F/N420S、H141R/N338D/G342D/R346H/K418P/G419F/N420S、H141R/P277N/N338D/G342D/K418P/G419F/N420S、H141R/P277N/P336D/N338D/G342D/K418P/G419F/N420S。


7.权利要求6所述的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白具有SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:162、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182、SEQIDNO:184、SEQIDNO:186、SEQIDNO:188、SEQIDNO:190、SEQIDNO:192、SEQIDNO:194、SEQIDNO:196、SEQIDNO:198、SEQIDNO:200、SEQIDNO:202、SEQIDNO:204、SEQIDNO:206、SEQIDNO:208、SEQIDNO:210、SEQIDNO:212、SEQIDNO:214、SEQIDNO:216、SEQIDNO:218、SEQIDNO:220、SEQIDNO:222、SEQIDNO:224、SEQIDNO:226、SEQIDNO:228、SEQIDNO:230、SEQIDNO:232、SEQIDNO:234、SEQIDNO:236、SEQIDNO:238、SEQIDNO:240、SEQIDNO:242、SEQIDNO:244、SEQIDNO:246、SEQIDNO:248、SEQIDNO:250、SEQIDNO:252、SEQIDNO:254、SEQIDNO:256、SEQIDNO:258或SEQIDNO:260所示的氨基酸序列。


8.一种融合蛋白，其中包含权利要求1-7中任一项所述的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段，以及与之融合的其它组分，例如标签肽如6×His，或者质体引导肽例如引导到叶绿体内的肽。


9.一种分离的多核苷酸，其中包含编码权利要求1-7中任一项的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段或者权利要求8中所述的融合蛋白的核酸序列或者其互补序列；所述的多核苷酸优选是DNA、RNA或者其杂合体；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：连磊，莫苏东，李华荣，苑广迪，李振国，张俊杰，丁德辉，陈波，刘桂智，宋超，王蕾，
申请(专利权)人：青岛清原化合物有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37