色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。本发明专利技术色氨酸2,3双加氧酶突变体由色氨酸2,3双加氧酶的氨基酸序列在第51位和第127位进行突变得到。本发明专利技术构建的生物催化剂可以利用不带有保护基的色氨酸、5‑氯色氨酸和6‑氯色氨酸作为底物，一步合成3a‑羟基六氢吡咯[2,3‑b]吲哚‑2‑羧酸（HPICs）及其衍生物。该新型酶将色氨酸双加氧酶转化为单加氧酶，其产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性；反应和纯化过程均在环保的水溶液中，在室温下进行，反映体系简单，反应条件温和，低能耗。

Tryptophan 2,3 dioxygenase mutant and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。
技术介绍
三元环的3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚-2-羧酸及衍生物（简称HPICs）是许多生物碱和多肽类中常见的分子骨架，具有强大的结构多样性和生物活性。例如，kapakahineC对P388小鼠白血病细胞具有细胞毒性；NWG家族中大部分天然产物(如NWG01)对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。除了抗菌活性外，himastatin和chloptosin还能抑制几种癌细胞系的生长。因此，含有HPICs结构单元的天然产物是合成和药理学研究的热门目标。HPIC还可以被氧化成pyrrolobenzoxazine合成中有用的中间体，例如：paeciloxazine、CJ12662和CJ12663。此外，具有HPICs骨架的单环肽可以利用酶法转化为生物活性提高的双环肽。因此，HPICs除了存在于各种各样的生物活性分子中，它也是重要的合成中间体。由色氨酸衍生物构建HPICs已被成为有机化学合成领域研究的热点。早先，Danishefsky能够以游离的Trp为底物，通过3-4步制备非对映选择性的HPICs，这为合成复杂的天然产物提供了有力策略。这些阳离子引发的环化反应利用N-苯基硒代酞酰亚胺(N-PSP)或N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)等亲电试剂来激活吲哚环;然后通过间氯过苯甲酸(mCPBA)或AgNO3水溶液氧化脱氮，实现氧原子取代活化的杂环原子。与上述分步方法不同，DMDO的氧化可以直接将Trp衍生物转化为HPICs，但非对映选择性取决于羧基和胺基的保护基团。如果没有像三苯甲基(Tr)和叔丁基(tBu)这样庞大的保护基团，得到的HPIC是1:1非对映体的混合物。最近，自由基引发的环化也被用于从受保护的Trp衍生物逐步制备HPIC。尽管取得了显著的进步，但是在制备HPIC的过程中需要多个保护基团，这不是一种环保的合成方式。为了解决这一问题，Nakagawa研究者已经尝试利用光敏通过两步/一锅法氧化未受保护的色氨酸，包括被Me2S还原裂解生成的三环过氧化物。反应过程虽然简单，但这种方法的立体选择性很差。此外，不稳定的过氧化物中间体易于迅速分解成N’-甲酰基犬尿氨酸(NFK)。2011年研究发现，色氨酸2,3双加氧酶xcTDO可以催化色氨酸通过一步反应生成HPIC，这为产生HPIC提供了一种新思路，但是由于反应主要生成NFK，HPIC产量极低的问题，限制了此酶合成HPICs的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，制备的色氨酸2,3双加氧酶突变体产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，含有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术还提供编码上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供包含上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸的载体。本专利技术还提供表达上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的细胞。本专利技术还提供一种提高色氨酸2,3双加氧酶催化效率的方法，将色氨酸2,3双加氧酶第51位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，将第127位的氨基酸残基谷氨酰胺替换为络氨酸。本专利技术还提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，包括：（1）构建表达野生型色氨酸2,3双加氧酶的质粒：将SEQIDNO:3核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；（2）通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库；（3）将步骤（1）、（2）构建的表达色氨酸2,3双加氧酶和突变体的质粒转化到大肠杆菌中；（4）色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的表达：将步骤（3）得到的菌种在LB液体培养基中过夜培养之后，加入TB液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；（5）含有色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（4）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；（6）含有色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（4）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；（7）色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的纯化：将步骤（5）的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合，然后于较低咪唑浓度下除去杂蛋白，最后用含有高浓度咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱；将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后-80℃保存。色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，具体步骤为：（1）色氨酸2,3双加氧酶TDO基因表达载体的构建：将全基因合成的xcTDO片段，经限制性内切酶NdeI和XhoI依据说明书进行双酶切操作后，用T4连接酶连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET22b（+）上；用连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞；从含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养；从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定；（2）色氨酸2,3双加氧酶突变体质粒的构建：将上述测序成功的质粒作为PCR的模板，通过Quickchange方法构建突变质粒并送测序鉴定；（3）色氨酸2,3双加氧酶TDO及突变体的制备：将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，将阳性克隆挑入5ml含有100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500ml含有100μg/ml卡那霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220rpm下进行扩培；待OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.5mM的IPTG诱导；在22℃，摇床转速220rpm下表达20h后，离心转速5000rpm离心10min收菌；舍弃上清培养基后，用85ml的bufferA将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000rpm，离心45min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以bufferA预处理的10ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含20mM，85mM咪唑的bufferC除去杂蛋白，并用bufferB将目的蛋白从柱上洗脱下来；目的蛋白的纯度由SDS-PAGE鉴定；将洗脱下的目的蛋白用bufferD4℃下过夜透析，以除去咪唑；离心浓缩后，-80℃下保存；其中bufferA为0.1MKPi（磷酸钾），0.3MKCl，10%甘油，pH7.8的缓冲液；bufferB为0.1MKPi，0.3MKCl，300mM咪唑，10%甘油本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，其特征是，含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，其特征是，含有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


2.编码如权利要求1所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸，其特征是，所述核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.包含如权利要求2所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸的载体。


4.表达权利要求1所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的细胞。


5.一种提高色氨酸2,3双加氧酶催化效率的方法，其特征是，将色氨酸2,3双加氧酶第51位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，将第127位的氨基酸残基谷氨酰胺替换为络氨酸。


6.一种色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，包括：
构建表达野生型色氨酸2,3双加氧酶xcTDO的质粒；
通过三轮定点饱和突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜庆，魏研欣，蒋胜胜，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32