本发明专利技术涉及一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒，涉及分子检测技术领域。本发明专利技术提供的可视化检测结核分枝杆菌的引物包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的序列如SEQ ID NO.4所示；所述LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的序列SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的可视化检测。
A set of primers and kits for visual detection of Mycobacterium tuberculosis
The invention relates to a set of primers and kits for visual detection of Mycobacterium tuberculosis, and relates to the technical field of molecular detection. The primers for visual detection of Mycobacterium tuberculosis provided by the invention include external primer pair F3 and B3, internal primer pair FIP and BIP and ring primer pair LF and LB; the sequence of F3 is as shown in SEQ ID No.1, the sequence of B3 is as shown in SEQ ID No.2; the sequence of FIP is as shown in SEQ ID No.3, the sequence of BiP is as shown in SEQ ID No.4; the sequence of LF is as shown in SEQ ID No.5, and the sequence of LB is as shown in SEQ ID No.4 Sequence SEQ ID No.6. The primer provided by the invention can realize the high specificity and high sensitivity visual detection of Mycobacterium tuberculosis.
【技术实现步骤摘要】
一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒
本专利技术涉及分子检测
，具体涉及一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium.tuberculosis)引起的严重影响人类健康的慢性传染病，是至今仍然困扰人类的古老疾病之一，在古埃及木乃伊中就已发现结核分枝杆菌的存在，即使在最近几年，每年还大约有900万人感染结核。随着耐药与多重耐药菌株的出现，结核病的控制难度不断增加，而建立快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病的防治工作具有重要意义，也是进行早期隔离、诊治的前提。目前，结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法、罗氏固体培养法、液体快速培养、核酸扩增等方法。染色涂片虽然简单易行，但敏感性差，检出率低。罗氏固体培养法培养周期长，需要4～8周，改进后液体快速培养系统将时间缩短到10天左右，但花费昂贵且容易受到污染。以扩增核酸为基础的实验技术，具有快速、灵敏、特异强等特点，但因PCR技术需要的热循环设备格昂贵而很难得到推广，且常规PCR方法的检测结果判定通常依据凝胶电泳和专业凝胶成像系统观测结果，而不能直接通过肉眼判定。目前结核分枝杆菌的检测需要一种准确、便捷、低成本和易于推广使用的高效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒。本专利技术提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的可视化检测。本专利技术提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQIDNO.1所示，所述B3的序列如SEQIDNO.2所示；所述FIP的序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP的序列如SEQIDNO.4所示；所述LF的序列如SEQIDNO.5所示，所述LB的序列SEQIDNO.6所示。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。优选的是，所述阴阳指示剂包括phenolsulfonphthalein。优选的是，所述外引物的使用终浓度各为0.2μM。优选的是，所述内引物的使用终浓度各为1.6μM。优选的是，所述环引物的使用终浓度各为0.8μM。优选的是，每25μL检测体系包括上述技术方案所述引物F3和B3各0.5μL，LF和LB各1.5μL，FIP和BIP各1μL，dNTP3μL，BstDNA聚合酶1μL和2×含阴阳指示剂的反应缓冲液12.5μL。本专利技术提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物。本专利技术提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的检测。试验结果表明，本专利技术对于结核分枝杆菌的检测特异性高，灵敏度可达5pg结核分枝杆菌基因组，完全可以满足结核分枝杆菌诊断要求。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的特异性检测结果图；图2为本专利技术实施例1提供的灵敏度检测结果图；图3为本专利技术实施例2提供的结核患者和健康人检测结果示意图；图4为本专利技术实施例3提供的不同反应温度检测结果图；图5为本专利技术实施例4提供的不同反应时间检测结果图。具体实施方式本专利技术提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述外引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述内引物对的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述环引物对的序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。在本专利技术中，所述可视化检测优选基于环介导等温扩增反应。本专利技术所述引物特异性强，基于所述引物的试剂盒检测特异性强、灵敏度高，且操作方便。本专利技术对所述引物的合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物合成公司进行合成即可。在本专利技术中，所述引物的核苷酸序列具体为：F3:5’-GCCGGTGTAGCTGGCT-3’(SEQIDNO.1)；B3:5’-CCAGGCGACATAGACAACAG-3’(SEQIDNO.2)；FIP:5’-CAAACCGGCAAGCGTCAGAGAAGCGGCCGGAGTTGA-3’(SEQIDNO.3)；BIP:5’-CGTCACTGTCGTCCCCTGTCCAAGCGTGCGGAAGCAAG-3’(SEQIDNO.4)；LF:5’-TCGGTCGCATCCGACAGT-3’(SEQIDNO.5)；LB:5’-AAACGCGCAATAAGAGACTGCA-3’(SEQIDNO.6)。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。在本专利技术中，所述反应缓冲液优选为LAMPbuffer。在本专利技术中，所述阴阳指示剂包括Phenolsulfonphthalein(PSP)，所述PSP能够感知环介导等温扩增反应中阳离子的数量的变化，而使反应体系颜色变化，阴阳指示剂在反应缓冲液中的浓度为0.1mM。在本专利技术中，所述外引物的终浓度各为0.2μM。在本专利技术中，所述内引物的终浓度各为1.6μM。在本专利技术中，所述环引物的终浓度各为0.8μM。具体地，为了更好地进行效果对比，本专利技术所述试剂盒优选还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照优选为结核分枝杆菌的混合液；所述阴性对照优选为非结核分枝杆菌，本专利技术对所述非结核分枝杆菌的种类没有具体限定。本专利技术所述试剂盒通过上述组分的组合，能够实现结核分枝杆菌的可视化检测，检测结果颜色差异明显，无需借助其它辅助设备，直接通过肉眼即可观察出扩增结果，颜色差异的灵敏度高。在本专利技术中，每25μL检测体系包括上述技术方案所述引物F3和B3各0.5μL，LF和LB各1.5μL，FIP和BIP各1μL，dNTP3μL，BstDNA聚合酶1μL和2×含阴阳指示剂的反应缓冲液12.5μL。在本专利技术中，所述dNTP的浓度优选为1.2mM。在本专利技术中，所述反应体系在具体检测时，优选添加2μL的模板DNA，水用于补足。本专利技术对所述水的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR用水即可，如ddH2O。本专利技术所述试剂盒在使用时，优选按照上述配比将各组分与样品混合后进行等温扩增。在本专利技术中，所述待测样品来自结核分枝杆菌DNA。所述试剂盒在用于结核分枝杆菌的检测时，所述检测的扩增程序优选为在恒温60～64℃反应40～70min，更优选为62℃反应50min。在本专利技术中，所述反应优选在恒温水浴装置中进行。在本专利技术中，用于终止反应的条件优选为80℃反应5min。得到扩增产物后，本专利技术直接肉眼观测检测结果，当检测结果的颜色为黄色时，检测结果为阳性；当检测结果的颜色为红色或粉红时，检测结果为阴性。本专利技术无需对反应产物进行进一步处理，直接通过观察反应液的颜色即可得到检测结果，且本专利技术检测灵敏度高，能够检测极限为5pg结核分枝本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的序列如SEQ IDNO.2所示；所述FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的序列如SEQ ID NO.4所示；所述LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的序列SEQ ID NO.6所示。/n
【技术特征摘要】
1.一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQIDNO.1所示，所述B3的序列如SEQIDNO.2所示；所述FIP的序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP的序列如SEQIDNO.4所示；所述LF的序列如SEQIDNO.5所示，所述LB的序列SEQIDNO.6所示。
2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴阳指示剂包括Phenolsul...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱超利，屈团昌，
申请(专利权)人：上海奥奈特生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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