一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种的方法，以及用于该方法的基因扩增引物。所述方法包括如下步骤：(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列；(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。本发明专利技术提供的高分辨率熔解曲线法扩增条件简单，反应快速，具有优异的灵敏度和特异性，可特异性的检出纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。

A method for identification of three Corynebacterium species by high resolution melting curve

The invention provides a method for identifying Corynebacterium species by using high-resolution melting curve method and a gene amplification primer for the method. The method comprises the following steps: (1) amplifying the interval sequence of SsrA gene of Corynebacterium by taking the DNA of the sample to be tested as the template; (2) obtaining the high-resolution fusion curve of the amplified product in step (1) by using the high-resolution fusion curve method; (3) interpreting the fusion curve obtained in step (2). The high-resolution fusion curve method has simple amplification conditions, fast reaction, excellent sensitivity and specificity, and can specifically detect Corynebacterium striatum, Corynebacterium propionate and Corynebacterium simulant.

【技术实现步骤摘要】
一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法
本专利技术涉及高分辨率熔解曲线在纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、丙酸棒状杆菌(Corynebacteriumpropinquum)和模拟棒状杆菌(Corynebacteriumsimulans)鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
技术介绍
棒状杆菌属(Corynebacteriumspp.)，属于放线菌目、棒状杆菌科，是一群革兰阳性菌，在自然界中广泛存在。该属种类繁多，过去人们主要关注白喉棒状杆菌，其致病力强，能产生强烈的外毒素而引起白喉。随着疫苗接种计划的有效实施，白喉棒状杆菌感染病例显著降低。然而，近年来由非白喉棒状杆菌(non-diphtheriaeCorynebacteriumspecies)导致的机会性感染、院内感染，甚至暴发感染逐渐增多。临床上主要表现为皮肤和软组织感染、呼吸道感染、尿路感染，有时引起严重的菌血症、脑膜炎、腹膜炎和心内膜炎等。值得注意的是，在这类快速新兴的棒状杆菌中，纹带棒状杆菌分离率最高，且大多为多重耐药菌，感染后可供选择的抗菌药物甚少，给临床治疗带来了很大的困难。准确、及时地将棒状杆菌鉴定至种水平，对疾病诊断和治疗至关重要。目前对于棒状杆菌的鉴定主要依赖于传统的痰涂片镜检和生化试验。然而，以上两种方法耗时耗力，且重复性差，易产生错判。16SrRNA和rpoB测序准确性高，但较为费时且价格昂贵，增加了鉴定的时间和经济成本。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization–timeofflight,MALDI-TOF-MS)简单、快速、有效，然而质谱在许多基层医院并未普及，且无法区分一些难以鉴别的棒状杆菌。事实上，一些棒状杆菌很难鉴定至种水平。例如，纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌具有相似的菌落形态和培养特性。纹带棒状杆菌和模拟棒状杆菌的16SrRNA基因同源性高达98％，其生化反应十分相似。此外，质谱法易将模拟棒状杆菌或丙酸棒状杆菌鉴定为纹带棒状杆菌。当前的诊断方法很少能够准确鉴定以上三种棒杆菌，并且大多数方法依赖于细菌的纯培养。因而，急需发展一种便捷、经济、灵敏和特异的诊断技术在种水平上区分纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。高分辨率熔解曲线(High-resolutionmelting,HRM)分析法是一种快速、低成本检测单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)的方法。该测定法在PCR扩增后无需额外仪器设备，仅根据PCR产物解链特征，鉴别核酸序列差异。聚合酶链反应过程中，荧光饱和染料与双链DNA结合。当温度升高时，双链DNA解链，荧光强度降低。通过实时监测升温过程中荧光染料强度，可形成熔解曲线。核苷酸序列的GC含量、长度和SNP位点会影响熔解曲线的位置和形状。根据熔解曲线的差异，可有效区分不同菌种。该方法简单、快速，易于操作，提取核酸后仅需2小时即可解读结果。此外，HRM不限于细菌培养物，可直接检测从临床样品中提取的DNA。考虑到痰涂片镜检、生化鉴定等方法耗时长、准确性低，16SrRNA检测成本高、MOLDI-TOFMS尚存偏差性及受限于细菌分离培养等问题，将HRM法用于棒状杆菌的快速检测十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了弥补现有技术的不足，应用高通量熔解曲线分析方法，同时鉴别三种棒状杆菌。建立快速、高灵敏性和高特异性的核酸检测体系，用以进行纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的快速鉴定。基于上述专利技术目的，本专利技术针对棒状杆菌的保守序列ssrA基因，首次提供了能鉴别上述三种棒状杆菌的特异性引物，其核苷酸序列为：F：TCAGCGTGACTACGCCCTC(SEQIDNO.1)，R：RCYTCGCCAGGGCTTCTCSEQIDNO.2)。反向引物加入两个简并碱基。本专利技术首先提供了一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列，所述区间序列为纹带棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，模拟棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，或者丙酸棒状杆菌ssrA基因的111-350bp；(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。在一个优选的实施方案中，所述基因扩增为荧光定量PCR扩增。在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上下游引物序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。更为优选地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。在一个优选的实施方案中，所述高分辨率熔解曲线法的熔解程序为：95℃10s，60℃1min，0.025℃/s升温至95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续监测荧光强度，得到荧光强度变化率-温度熔解曲线。在一个更为优选的实施方案中，在所述高分辨率熔解曲线法中使用的荧光染料为Evagreen。在又一个优选的实施方案中，所述棒状杆菌包括纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。更为优选地，在步骤(3)所述判读中，纹带棒状杆菌Tm值为88.910℃；丙酸棒状杆菌Tm值为88.438℃；模拟棒状杆菌Tm值为87.855℃。其次，本专利技术还提供了一组用于高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种中基因扩增引物的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。最后，本专利技术还提供了一种使用上述多核苷酸分子并以高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种的检测方法。本专利技术可用于细菌培养物和人体分泌物样本中纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的检测，为疾病监测提供可靠依据。本专利技术公开的高分辨率熔解曲线法具有快速、经济、便捷、敏感、特异等优点。首先，本专利技术提供的方法可在2h内完成整个反应体系的扩增。HRM采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行PCR产物电泳检测，简化操作流程，降低实验检测成本，避免样品和环境的交叉污染。其次，本专利技术提供的方法灵敏度高。对纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的检测下限为100fg,灵敏度达100％。第三，本专利技术提供的扩增方法具有很高的特异性。在标准反应条件下，运用HRM技术检测30种常见致病菌和机会致病菌时未出现非特异性扩增，阳性扩增仅出现在纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌，说明该检测体系的特异性良好。附图说明图1.三种棒状杆菌ssrA序列比对结果；图2A.鉴别三种棒状杆菌的导数熔解曲线图；图2B.鉴别三种棒状杆菌的标准化熔解曲线图；图2C.鉴别三种棒状杆菌的熔解曲线差值图；图3.高分辨率熔解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：/n(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列，所述区间序列为纹带棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，模拟棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，或者丙酸棒状杆菌ssrA基因的111-350bp；/n(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；/n(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。/n

【技术特征摘要】
1.一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列，所述区间序列为纹带棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，模拟棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，或者丙酸棒状杆菌ssrA基因的111-350bp；
(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；
(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因扩增为荧光定量PCR扩增。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的上下游引物序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。


5.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振军，侯雪新，徐帅，周海健，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11