一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，包括以下步骤：S1、血液中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取；S2、PCR检测：S2.1、利用金黄色葡萄球菌基因组DNA序列设计特异性的PCR引物，正向引物：5’‑ATCGCACGCTTCGCCTAT‑3’；反向引物：5’‑CGTCCGCTCTGGGTTAGT‑3’；引物的扩增片段长度为135bp；S2.2、以从血液中提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为135bp的片段判定为检测出金黄色葡萄球菌。本发明专利技术通过PCR技术快速高效地检测出临床血液中金黄色葡萄球菌的感染，对血液中金黄色葡萄球菌的检测下限达到10CFU/mL。

A method to detect the pathogenic bacteria of Staphylococcus aureus from clinical blood

The invention provides a method for detecting pathogenic bacteria of Staphylococcus aureus in clinical blood, which comprises the following steps: S1, extraction of genomic DNA of Staphylococcus aureus in blood; S2, PCR detection: s2.1, design specific PCR primers by using genomic DNA sequence of Staphylococcus aureus, forward primers: 5 '\u2011 atcgcacgctcgcctat \u2011 3'; reverse primers: 5 '\u2011 cgtcctctg GGTTAGT \3\; primers were amplified by 135bp; S2.2, and Staphylococcus aureus genomic DNA extracted from blood was used as template; PCR was amplified by PCR primers; S2.3, PCR amplified products were agarose gel electrophoresis and detection, and the length of 135bp fragment was determined to detect Staphylococcus aureus. The invention can quickly and efficiently detect the infection of Staphylococcus aureus in clinical blood by PCR technology, and the detection limit of Staphylococcus aureus in blood reaches 10cfu / ml.

【技术实现步骤摘要】
一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法
本专利技术涉及血液感染病原菌的检测
，具体涉及一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法。
技术介绍
血流感染引起的菌血症或败血症等疾病越来越受到临床治疗的关注。目前，医院内部检验科室传统的对病原菌如金黄色葡萄球菌等检测方法包括菌体培养、菌体形态观察、生化反应实验和药敏反应实验等。这些传统的鉴定方法主要需要依靠对血液中金黄色葡萄球菌等菌体的培养，一般需要3-5天甚至更久的时间。另外，传统的检测方法需要依托特定的实验仪器进行，如细菌培养的有氧或无氧培养瓶和培养箱等，操作复杂，人力成本高。这些技术上的局限性导致医院临床传统的血流感染检测耗时且检测效率低。所以，专利技术一种可以快速、简单和高效地检测血流感染的病原菌具有十分广阔的临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，首先简单快速地提取出血样中金黄色葡萄球菌的基因组DNA；再利用金黄色葡萄球菌的特异基因设计优化特异性PCR反应引物，通过PCR技术快速高效地检测出临床血液中金黄色葡萄球菌的感染。为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，包括以下步骤：S1、血液中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取；S2、血液中金黄色葡萄球菌PCR检测S2.1、利用金黄色葡萄球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物如SEQIDNO.1所示：5’-ATCGCACGCTTCGCCTAT-3’；所述反向引物如SEQIDNO.2所示：5’-CGTCCGCTCTGGGTTAGT-3’；引物的扩增片段长度为135bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为135bp的片段则判定为检测出金黄色葡萄球菌。优选地，步骤S1中，血液样品中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；S1.3、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；S1.4、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.5、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.6、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMTris-HCl(pH8.0)混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.7、重复步骤S1.61次；S1.8、空DNA吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将DNA吸附柱转移至1.5mL离心管内；S1.9、向空DNA吸附柱膜中央加入30μL10mMTris-HCl和1mMEDTA混合液，pH为8.0-8.5；12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组DNA。优选地，步骤S1.1中，酶裂解液中含有：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶ClyH、10mg/mL溶菌酶、25mMTris-HCl、10mMEDTA，pH8.0-8.5。优选地，步骤S1.2中，碱裂解液中含有：0.2MNaOH，1％SDS，pH12-14。优选地，步骤S1.3中，去杂液中含有：4MNH4Ac-HAc，pH4.5-4.8。优选地，步骤S2.2中，PCR扩增时PCR的反应体系为：2倍FlashHotStartMasterMix5μL，2μmol/L的正向引物1μL，2μmol/L的反向引物1μL，基因组DNA模板1μL，双蒸水补足至10μL；PCR的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。优选地，步骤S2.2中，提供金黄色葡萄球菌基因组DNA提取的菌含量≥10CFU/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术技术方案立足血液病原菌感染的临床检测实际，建立了一种快速高效的血液中金黄色葡萄球菌检测方法。利用该方法可以成功检测到临床阳性血液样品中金黄色葡萄球菌的感染。使用该方法可以极大的提高血液中检测金黄色葡萄球菌的时效性，将临床检测周期从传统培养方法的5-7天缩短为2-3个小时。同时，本专利技术对血液中金黄色葡萄球菌的检测极限提达到10CFU/mL。本专利技术建立的PCR检测方法若应用在临床实际中，将大幅度提高临床上对血液中金黄色葡萄球菌的检测效率和灵敏度，为后续指导医师用药和临床治疗提供及时有效的参考指标。该方法具有操作简单方便，检测速度快，特异性强，灵敏度高，稳定性高等显著优势。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中的所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为金黄色葡萄球菌引物检测的特异性实验结果；其中，1：Marker(100bp)；2：沙门氏菌；3：绿脓杆菌；4：单核细胞增生李斯特菌；5：肺炎克雷伯菌；6：阳性对照；7：金黄色葡萄球菌；8：阴性对照；9：大肠杆菌。图2为金黄色葡萄球菌引物检测的灵敏度实验结果；其中，1：Marker(100bp)；2：阴性对照；3：阳性对照；4-8：分别为109，107，105，103，10CFU/mL金黄色葡萄球菌。图3为血液中金黄色葡萄球菌检测方法的临床应用实例；其中，1：阴性对照组；3：Marker(100bp)；2、4-8：分别为临床血液实验组。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：特异性的PCR引物设计利用金黄色葡萄球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；正向引物如SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、血液中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取；/nS2、血液中金黄色葡萄球菌PCR检测：/nS2.1、利用金黄色葡萄球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；/n所述正向引物如SEQ ID NO.1所示：5’-ATCGCACGCTTCGCCTAT-3’；/n所述反向引物如SEQ ID NO.2所示：5’-CGTCCGCTCTGGGTTAGT-3’；/n引物的扩增片段长度为135bp；/nS2.2、以步骤S1中从血液中提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；/nS2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为135bp的片段则判定为检测出金黄色葡萄球菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、血液中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取；
S2、血液中金黄色葡萄球菌PCR检测：
S2.1、利用金黄色葡萄球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；
所述正向引物如SEQIDNO.1所示：5’-ATCGCACGCTTCGCCTAT-3’；
所述反向引物如SEQIDNO.2所示：5’-CGTCCGCTCTGGGTTAGT-3’；
引物的扩增片段长度为135bp；
S2.2、以步骤S1中从血液中提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；
S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为135bp的片段则判定为检测出金黄色葡萄球菌。


2.根据权利要求1所述的从临床血液中检测金黄色葡萄球菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1中，血液样品中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：
S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；
S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；
S1.3、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；
S1.4、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
S1.5、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
S1.6、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMpH8.0的Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敬，王旭，孙宝林，郭建，吴谨，
申请(专利权)人：卓源健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34