一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，包括以下步骤：S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；引物所扩增的目的片段长度为411bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。本发明专利技术对血液中肺炎克雷伯菌的检测极限达到10CFU/mL。本发明专利技术不仅提高了血液中肺炎克雷伯菌感染的检测灵敏度，而且缩短了检测周期。

A method to detect Klebsiella pneumoniae from clinical blood

The invention provides a method for detecting Klebsiella pneumoniae pathogenic bacteria in clinical blood, which comprises the following steps: S1. Extraction of Klebsiella pneumoniae genomic DNA in blood; S2. PCR detection of Klebsiella pneumoniae in blood: s2.1. Design a specific PCR primer using Klebsiella pneumoniae genomic DNA sequence, including forward primer and SEQ ID No.2 as shown in SEQ ID No.1 The primers were amplified by the primers. The length of the target fragment was 411bp; S2.2, the genomic DNA of Klebsiella pneumoniae extracted from blood was used as template in step S1, PCR amplification was performed with specific PCR primers; S2.3, PCR amplified products were agarose gel electrophoresis and detection, and the length of 411bp fragment was determined to detect Klebsiella pneumoniae pathogenic bacteria. The detection limit of the invention for Klebsiella pneumoniae in blood reaches 10 CFU / ml. The invention not only improves the detection sensitivity of Klebsiella pneumoniae infection in blood, but also shortens the detection cycle.

【技术实现步骤摘要】
一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法
本专利技术涉及血液感染病原菌的检测
，具体涉及一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法。
技术介绍
肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，已成为医院获得性感染的重要条件致病菌之一。肺炎克雷伯菌导致的血流感染在革兰氏阴性菌引起的血流感染中位列前茅。肺炎克雷伯菌引起的血流感染不仅伴随着多种如肺炎感染等的并发症，而且具有极高的发病率和死亡率。目前，针对临床血液中肺炎克雷伯菌的检测，传统的院内检验方法需要经过24-48h的菌种培养步骤，再到后续的生理生化或耐药性分析等，会经过一系列耗时和复杂的中间检测步骤。这种临床传统检测方法往往会错过已感染病人的及时诊断，而不能实时地为临床医师提供用药指导，从而错过感染病人的最佳治疗时间。所以，寻找一种快速简单和高效率的检测血样中肺炎克雷伯菌的方法具有重大的临床意义和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，解决了医院传统的临床血液中肺炎克雷伯菌感染检测周期长的技术局限，同时在检测效率上也有了较大的提升；本专利技术为简单快速、特异和高效的临床血液检测肺炎克雷伯菌感染的方法，首先简单快速地提取出血样中肺炎克雷伯菌的基因组DNA；再利用待测肺炎克雷伯菌的特异基因设计特异性PCR扩增引物，通过PCR反应快速高效地检测出临床血液中肺炎克雷伯菌感染。为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，包括以下步骤：S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括如SEQIDNO.1所示的正向引物和SEQIDNO.2所示的反向引物；其中，SEQIDNO.1：5’-GTTGTTCCCGTTATGTCTGGTGC-3’；SEQIDNO.2：5’-GCTATCAGCGCCACGTTAGC-3’；引物所扩增的目的片段长度为411bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。优选地，步骤S1中，血液样品中肺炎克雷伯菌病原菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；S1.3、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；S1.4、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.5、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.6、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMTris-HCl(pH8.0)混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.7、重复步骤S1.61次；S1.8、空DNA吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将DNA吸附柱转移至1.5mL离心管内；S1.9、向空DNA吸附柱膜中央加入30μL10mMTris-HCl和1mMEDTA混合液，pH为8.0-8.5；12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组DNA。优选地，步骤S1.1中，酶裂解液中含有：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶ClyH、10mg/mL溶菌酶、25mMTris-HCl、10mMEDTA，pH8.0-8.5。优选地，步骤S1.2中，碱裂解液中含有：0.2MNaOH，1％SDS，pH12-14。优选地，步骤S1.3中，去杂液中含有：4MNH4Ac-HAc，pH4.5-4.8。优选地，步骤S2.2中，PCR的反应体系为：2倍FlashHotStartMasterMix5μL，2μmol/L的正向引物1μL，2μmol/L的反向引物1μL，基因组DNA模板1μL，双蒸水补足至10μL。优选地，步骤S2.2中，PCR的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。步骤S2中，提供肺炎克雷伯菌基因组DNA提取的菌含量≥10CFU/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术技术方案从血流感染的病原菌的临床检测实际出发，研发和建立了一种快速高效的血液中肺炎克雷伯菌感染的检测方法。利用该专利技术方法可成功检测出临床血液样品中感染的肺炎克雷伯菌。本专利技术方法不仅可以极大的提高血液中肺炎克雷伯菌感染的检测效率，简化了临床上传统的通过培养增菌等复杂的检测方法。而且，本专利技术对血液中肺炎克雷伯菌的检测极限达到10CFU/mL，临床检测应用的灵敏度高。本专利技术所建立的PCR检测方法具有重要的临床应用价值，不仅大幅度提高检测效率，临床上对血液中肺炎克雷伯菌感染检测的特异性和灵敏度都有提高；而且检测周期也极大的缩短。本专利技术实现了临床血液样品中肺炎克雷伯菌感染的快速特异检测诊断，为进一步临床治疗以及指导医师用药提供及时的参考数据，而为感染病人提供宝贵的早期及时治疗。该专利技术方法具有操作简单方便，检测速度快，特异性高，灵敏度高，稳定性强等显著优势。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中的所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为肺炎克雷伯菌引物检测的特异性实验结果图；其中，1：Marker(100bp)；2：沙门氏菌；3：绿脓杆菌；4：单核细胞增生李斯特菌；5：金黄色葡萄球菌；6：大肠埃希菌；7：肺炎克雷伯菌；8：阴性对照组。图2为血液中肺炎克雷伯菌检测的灵敏度实验结果图；其中，1：Marker(100bp)；2：阴性对照；3：阴性血样；4-8：分别为109，107，105，103，10CFU/mL菌量的肺炎克雷伯菌。图3为血液中肺炎克雷伯菌检测方法的临床应用实例；其中，1：Marker(100bp)；2-7：分别为临床血液实验组，8：阴性对照。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一：PCR引物的设计利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；其中，SEQ ID NO.1：5’‑GTTGTTCCCGTTATGTCTGGTGC‑3’；SEQ ID NO.2：5’‑GCTATCAGCGCCACGTTAGC‑3’；引物所扩增的目的片段长度为411bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。

【技术特征摘要】
1.一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括如SEQIDNO.1所示的正向引物和SEQIDNO.2所示的反向引物；其中，SEQIDNO.1：5’-GTTGTTCCCGTTATGTCTGGTGC-3’；SEQIDNO.2：5’-GCTATCAGCGCCACGTTAGC-3’；引物所扩增的目的片段长度为411bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。2.根据权利要求1所述的从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，其特征在于，步骤S1中，血液样品中肺炎克雷伯菌病原菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；S1.3、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；S1.4、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.5、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；S1.6、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMpH8.0的Tris-HCl混...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敬，王旭，孙宝林，郭建，吴谨，
申请(专利权)人：卓源健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34