一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。该方法包括：将待测单增李斯特菌菌株进行增菌培养，得到增菌培养液；提取增菌培养液的DNA，将DNA提取液、PCR引物与PCR反应物混合均匀，进行PCR反应，得到PCR反应产物；将PCR反应产物电泳，根据电泳结果判断待检测菌的血清型。本发明专利技术针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，并建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。这些靶标具有准确度高和特异性好的特点。该方法具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、成本低廉及操作简单的特点。

A multiplex PCR method for serotype identification of Listeria monocytogenes based on specific targets

The invention discloses a multiplex PCR method for identifying Listeria monocytogenes serotype based on a specific target. The method includes: culturing the Listeria monocytogenes to be tested to obtain the culture medium; extracting the DNA of the culture medium, mixing the DNA extract, PCR primer and PCR reactant evenly, carrying out PCR reaction to obtain the PCR reaction product; electrophoresis of the PCR reaction product, and judging the serotype of the bacteria to be tested according to the electrophoresis result. The invention designs specific primers for lmo2644, lmofs2365, lmo1119 and lmo0733 genes, which are specific targets of newly excavated Listeria monocytogenes serotype, and establishes PCR identification method for Listeria monocytogenes serotype. These targets have the characteristics of high accuracy and good specificity. This method has the characteristics of high accuracy, good specificity, fast identification speed, low cost and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法
本专利技术属于生物
，具体涉一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。根据菌体和鞭毛抗原的血清型反应，单增李斯特菌可被分为13个血清型，分别为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7型。其中，1/2a、1/2b、1/2c、4b这4种血清型是主要的血清型，99％的人类李斯特菌病由这四种血清型的菌株引起。1/2a血清型是食品中最为常见的血清型，但李斯特菌病的暴发性流行大多是由4b血清型的菌株引起的，这说明4b血清型可能具有更强的毒力。以上13种血清型可进一步被分为5个血清群(serogroup)，1/2a和3a型属于IIa群，1/2b、3b和7型属于IIb群，1/2c和3c型属于IIc群，4b、4d和4e型属于IVb群，4a和4c型属于L群。对单增李斯特菌的血清型鉴定，在其流行株的监测、食品安全性评估及暴发疫情的病原学溯源中具有重要的应用价值。目前，对单增李斯特菌血清型的鉴定方法主要是血清型方法(可见出入境检验检疫行业标准SN-T2521-2010)，此种方法需要使用菌毛抗原和菌体抗原，成本较高，操作复杂，易发生交叉反应，且鉴定周期较长，完成一次鉴定需要3天以上的时间。现有专利中，单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法，如CN107746890A、CN103602739A等专利中使用的靶标使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少准确度和特异性都较好的单增李斯特菌血清型PCR鉴定引物；然而，目前对单增李斯特菌血清型的新PCR鉴定靶标的挖掘的相关文献报道较少。对其新PCR鉴定靶标的挖掘和新的PCR鉴定方法的建立，有助于提高单增李斯特菌血清型PCR鉴定的准确度和特异性。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。本专利技术提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，是一种特异性好、鉴定速度快、成本低廉、操作简单的单增李斯特菌的PCR鉴定方法。本专利技术提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，该PCR方法使用的血清群IIa、IIc、L特异性靶标基因为lmo2644，血清群IVb、L特异性靶标基因为LMOf2365_0118、血清群IIc的特异性靶标基因为lmo1119、单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733。本专利技术公开了一组单增李斯特菌血清型的特异性靶标，及其对应的血清型鉴定引物和鉴定方法。本专利技术针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，并建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。所述特异性靶标通过比较基因组学和生物信息学挖掘获得，该组靶标具有准确度高和特异性好的特点。本专利技术的PCR血清型鉴定方法具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、成本低廉、操作简单的特点。本专利技术提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，使用的引物序列为：lmo2644-F：5’-ACGGTATTACTTAGCGATGTGC-3’，lmo2644-R：5’-CAAACTCAAAATAAACGCTTCAA-3’，其对应的特征DNA片段为669bp；LMOf2365_0118-F：5’-ACCGACCAATGTCTACACGC-3’，LMOf2365_0118-R：5’-TTCACGCATTCTGGCATCT-3’，其对应的特征DNA片段为889bp；lmo1119-F：5’-GTGGTTCTGGTCTTGCCTTAG-3’，lmo1119-R：5’-GATTGAGAAAGAGGGTTGAAAA-3’，其对应的特征DNA片段为243bp；lmo0733-F：5’-AAAGCAATCAGAAAATCAAAAGG-3’，lmo0733-R：5’-GTACGATTTTATACGTTCTTCCGC-3’，其对应的特征DNA片段为500bp。本专利技术提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，包括如下步骤：(1)将待测单增李斯特菌菌株接种至培养基(优选TSB培养基)中进行增菌培养，得到增菌培养液；(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；(3)将步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液、所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；(4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤(1)所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤(1)所述待鉴定的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。进一步地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36～38℃，增菌培养的时间为8～12h，所述增菌培养的摇床转速为210～230rpm。优选地，步骤(1)所述培养基为TSB培养基(即胰酪大豆胨液体培养基)。优选地，步骤(1)所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为37℃，增菌培养的时间为10h，所述增菌培养的摇床转速为220rpm。进一步地，步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液中的DNA浓度为10～500ng/μL。进一步地，步骤(3)所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物LMOf2365_0118、PCR引物lmo0733及PCR引物lmo1119。进一步地，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R；所述正向引物lmo2644-F如SEQIDNO：1所示，所述反向引物lmo2644-R如SEQIDNO：2所示；所述PCR引物LMOf2365_0118包括正向引物LMO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将待测单增李斯特菌菌株接种至培养基中进行增菌培养，得到增菌培养液；（2）使用试剂盒法提取步骤（1）所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；（3）将步骤（2）所述待鉴定的DNA提取液、所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；（4）将步骤（3）所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤（1）所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤（1）所述待鉴定的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将待测单增李斯特菌菌株接种至培养基中进行增菌培养，得到增菌培养液；（2）使用试剂盒法提取步骤（1）所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；（3）将步骤（2）所述待鉴定的DNA提取液、所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；（4）将步骤（3）所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤（1）所述待测单增李斯特菌菌株的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤（1）所述待鉴定的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。2.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（1）所述培养基为TSB培养基；所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36~38℃，增菌培养的时间为8~12h，所述增菌培养的摇床转速为210~230rpm。3.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（2）所述待鉴定的DNA提取液中的DNA浓度为10-500ng/μL。4.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤（3）所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物LMOf2365_0118、PCR引物lmo1119及PCR引物lmo0733。5.根据权利要求4所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R；所述正向引物lmo2644-F如SEQIDNO：1所示，所述反向引物lmo26...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萍，叶燕锐，林章凛，才艺，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44