一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术制造技术

本发明专利技术公开一种以肽聚糖水解酶pcsB基因为靶序列的环介导等温扩增快速检测无乳链球菌的方法，所述引物含SEQID.NO.1‑2的内引物，SEQID.NO.3‑4的外引物和SEQID.NO.5的环引物。其特征在于：1）64°C,1小时LAMP反应，通过实时浊度仪可有效检测无乳链球菌的最低基因组模板量为1 pg，灵敏度是普通PCR电泳分析和荧光PCR的100倍。2）以SYBR Green I为显色试剂，LAMP反应1‑3小时可对1 ng模板的无乳链球菌进行准确检测。

A field rapid detection technique of Streptococcus lactis loop mediated isothermal amplification based on pcsB gene

The invention discloses a method for rapid detection of Streptococcus lactis by loop mediated isothermal amplification with peptidoglycan hydrolase pcsB gene as the target sequence. The primers include inner primer of SEQ id.no.1-2, outer primer of SEQ id.no.3-4 and ring primer of SEQ id.no.5. It is characterized by: 1) 64 \u00b0 C, one hour LAMP reaction, the minimum amount of genomic template for the detection of S. lactis by real-time turbidimeter is 1 PG, and the sensitivity is 100 times higher than that of ordinary PCR electrophoresis analysis and fluorescent PCR. 2) SYBR Green I was used as the chromogenic reagent, and lamp reaction for 1-3 hours could detect Streptococcus lactis without 1 ng template accurately.

【技术实现步骤摘要】
一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术
本专利技术涉及微生物检测
，具体说是涉及一种快速、可视化检测无乳链球菌的环介导等温扩增方法。
技术介绍
无乳链球菌（Streptococcusagalactiae，GBS）、又称为B群链球菌（GroupBStreptococcus）在分类上隶属细菌界(Bacteria)、厚壁菌门（Firmicutes）、芽胞杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌科（Streptococcaceae）、链球菌属（Streptococcus）、无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）。其分类特征为链球状革兰氏阳性菌，无运动性、不产芽孢和过氧化氢酶阴性。在危害方面，该菌寄存于产妇生殖道内（携带率为4.6%～25.4%），造成孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎，因此，在许多国家和地区，如美国、欧洲等无乳链球菌已作为孕妇产检的常规筛查中的必检项目，在我国的一些地方也是重要的建议孕妇筛查项目；同时，该菌也是奶牛乳腺炎的主要病原体，造成牛奶产量下降和污染；另外，该菌在养殖鱼类的危害也非常严重，是导致罗非鱼大量死亡的主要链球菌，因此，该菌在农业的奶牛养殖和水产养殖中都是重要的必检项目之一。目前，无乳链球菌的检测技术主要有常规生理生化方法和分子生物学方法。在常规生理生化方法鉴定方面，主要采用的生化指标有：革兰氏染色、ELISA实验、CAMP实验、V-P反应(福格斯-普利斯考尔)产物实验、过氧化氧酶实验、氧化酶实验、凝集实验和Lancefield氏群特异性抗原群鉴定等。这些鉴定方法的不足主要是操作复杂，耗时长和特异性不强等。目前市场上有代表性的自动快速细菌鉴定系统，如APIrapidstrep32、API20EVitek、RAPIDStrepstri系统和ATB快速检测系统等，该类检测系统的不足是受其数据库中模式菌株的数量限制，检测结果并不稳定。在分子生物学鉴定方面，常规方法是16SrRNA基因测序，但需要较长的时间完成。其次是以16SrRNA基因、CAMP因子基因cfb、乳酸氧化酶基因lctO和16S-23SrDNA序列等为靶基因而建立的快速PCR、双重PCR和巢式PCR等鉴定方法，目前市场上有GBSGeneXpert,BDMAXGBS和BDtheGeneOhmTMStrepB等。PCR方法的优点是快速准确，缺点是需要有PCR仪和电泳设备等，所以对实验室的依赖度较高，难以在现场或基层应用。针对条件一般的医院以及农业上的现场疫情监控，近些年来，以LAMP、重组酶等温扩增（Isothermalrecombinasepolymeraseamplificationassay,RPA）为代表的GBS现场检测技术快速发展。文献中已报道的有采用16SrRNA基因，毒力因子基因fbsB、cfb和sip等，但真正可查的具有实际应用的无乳链球菌LAMP方法并不多见。分析其原因应与所设计引物的特异性和反应灵敏度有关。因此，针对当前无乳链球菌检测方法的不足，本专利技术采用新颖的pcsB基因，通过引物设计和体系优化，建立了一套更为稳定的LAMP快速检测技术。
技术实现思路
本专利技术目的是为基层医院、农业、水产业或食品业提供一种简便、快捷的无乳链球菌检测方法。所使用的技术方案是：一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，该方法包括试剂有：10×LAMPMix引物、2×LAMPMix反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和无乳链球菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物有F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO）：4以及加速引物LF（SEQIDNO：5）。其中LAMP引物序列为：F3:AAGTTGAGTCTGCCACAG（18bp）；B3:CTGACAACAGGTTTTGATACC（21bp）；FIP:GCCGAAGAAGTAGCCGTAAGATTATTTTAAACAGTTCAAACACAACCG(48bp）；BIP:AATGAGCCAAAAGTTACTCAACCTTTTGCTCTAGGTGTTGAAGAAAC（47bp）；LF:TGTCGAGGATGACTT（15bp）;其中LAMP引物为混合的10×Mix引物，其中各引物的具体浓度分别为8μMFIP;8μMBIP;2μMF3;2μMB3;4μMLP。所述的反应缓冲液终浓度为20mMTris-HCl(pH8.8@25℃)；10mM(NH4)2SO4；50mMKCl；2mMMgSO4；0.1%Tween®20；200μMdATP；200μMdCTP；200μMdGTP；100μM[3H]dTTP；100μg/mLBSA。所述的无乳链球菌DNA模板是经细菌基因组DNA提取试剂盒提取或经煮沸后的样品裂解上清液的DNA样本。所述的2×LAMPMix反应缓冲液40mMTris-HCl(pH8.8@25℃)；20mM(NH4)2SO4；100mMKCl；4MgSO4；0.2%Tween®20；400μMdATP；400μMdCTP；400μMdGTP；200μM[3H]dTTP；200μg/mLBSA。其配制方法在pH为9.0条件下，将上述溶剂混合均匀获得。以上所述的荧光目视检测试剂为羟基萘酚蓝（HNB）（反应前加入）或SYRB荧光试剂（反应后加入）。一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，用于无乳链球菌检测，具体的设计与检测步骤包括：（1）LAMP反应体系的建立（2）无乳链球菌模板DNA样品制备（3）LAMP产物检测以上所述的LAMP反应体系建立中的LAMP反应体系以20μl计，具体成份如下：表1LAMP反应体系(20μl)成份样品管阴性对照LAMPMix（2×）10μL10μLaFIP引物终浓度0.8μM0.8μMaBIP引物终浓度0.8μM0.8μMaF3引物终浓度0.2μM0.2μMaB3引物终浓度0.2μM0.2μMaLoopF引物终浓度0.4μM0.4μMMgCl2（25mM）3μL3μL灭菌水补至终体积20μL补至终体积20μLBstDNA聚合酶(8U/μl)1.5μL1.5μLb模板DNA1-3μl(1-100ng)-/1-100ngA群链球菌基因组注：“-”为不加DNA。a引物需在使用前预混合至10×LAMPMix，以方便使用。b模板为最后添加，在实际检测前其他所有成份需预混装至检测PCR管内，预留3μl用于样品DNA添加。以上所述的LAMP引物是采用LAMP（LA-500）实时浊度仪，通过特异性检测和敏感性检测筛查获得。本专利技术的实质性特点和显著进步是：准确性更高本方法采用pcsB为靶基因进行引物设计。pcsB编码无乳链球菌的肽聚糖水解酶，在该菌细胞壁代谢中发挥重要功能，该基因突变可严重降低GBS的存活机率。同已报道的毒力因子基因fbsB、cfb和sip等相比，该基因在GBS中具有更大的广泛性和更强的保守性。同时与已报道的16SrRNA基因相比，该基因比其具有更大的变异性。因此，在理论上，本检测方法可有效避免依16SrRNA基因所设计的LAMP检测方法的假阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，其特征在于以肽聚糖水解酶基因

【技术特征摘要】
2018.05.23 CN 20181049860751.一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，其特征在于以肽聚糖水解酶基因pcsB为分子靶标，设计环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）引物。2.检测试剂包括10×LAMPMix引物、2×LAMPMix反应缓冲液、BstDNA聚合酶(8U/μl)、MgCl2（25mM）、荧光检测试剂、超纯水和无乳链球菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物：F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物：FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环加速引物LF（SEQIDNO：5）；其中引物的序列分别为：F3AAGTTGAGTCTGCCACAG（18bp）；B3CTGACAACAGGTTTTGATACC（21bp）；FIPGCCGAAGAAGTAGCCGTAAGATTATTTTAAACAGTTCAAACACAACCG（48bp）；BIPAATGAGCCAAAAGTTACTCAACCTTTTGCTCTAGGTGTTGAAGAAAC（47bp）；LFTGTCGAGGATGACTT（15bp）;3.根据权利要求1所述的一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，其特征在于，所述的无乳链球菌DNA模板是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取无乳链球菌培养物的基因组DNA，但不排除在实际应用中采用高温煮沸的裂解上清液。4.根据权利要求1所述的一种基于pcsB基因的无乳链球菌环介导等温扩增现场快检技术，其特征在于，所述的LAMP引物是以pcsB基因为序列基础，经实时浊度仪对其特异性、敏感性和准确性评价后确定。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑继平，郭桂英，曾纪锋，杨诺，李迁，周楚新，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46