一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒。本发明专利技术所述的检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒包括：以胎儿弯曲菌龟亚种的COA基因作为靶基因设计的正向引物和反向引物。本发明专利技术所述的试剂盒不仅可以检测龟亚种，还可用来区分龟亚种和胎儿亚种、性病亚种。

A PCR kit for detection of Campylobacter foetus

The invention discloses a PCR kit for detecting Campylobacter foetus subspecies. The PCR kit for detecting Campylobacter foetus subspecies includes a forward primer and a reverse primer designed with the COA gene of Campylobacter foetus subspecies as the target gene. The kit can not only detect tortoise subspecies, but also distinguish tortoise subspecies, fetal subspecies and venereal diseases subspecies.

【技术实现步骤摘要】
一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒
本专利技术属于生物医药
，涉及一种PCR检测试剂盒，特别是涉及一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒。
技术介绍
弯曲菌属是一类革兰氏阴性，氧化酶触酶阳性，呈S形、或螺旋状弯曲，单极或双极鞭毛、嗜微需氧生长的人兽共患传染病病原体。弯曲菌常定居于温血动物(如家禽、野鸟)的肠道内，以“粪-口传播”的方式传染给人类，主要引起一种“痢疾样”急性腹泻性疾病。而胎儿弯曲菌(Campylobacterfetus)可导致人体肠道外感染如早产、菌血症、腹膜炎、脑膜炎、关节炎等。胎儿弯曲菌按照宿主的不同及所致疾病的差异可分为三个亚种：胎儿亚种、性病亚种和龟亚种。胎儿亚种来源于牛羊及鸟类，可导致牛羊早产，但症状较轻；性病亚种主要来源于牛，可导致牛羊流产、生殖道炎症；龟亚种来源于爬行动物并具有独特的分子特征，因此对亚种的准确鉴定可以推测其感染的来源，为流行病学调查提供依据。胎儿弯曲菌三个亚种之间的生化反应差异较小：1％甘氨酸生长实验性病亚种为阳性，而胎儿亚种和龟亚种为阴性，目前不能根据生化试验将其三个亚种之间进行区分。文献报道使用多重PCR鉴别胎儿亚种和性病亚种的原理为扩增针对胎儿弯曲菌CstA基因和针对性病亚种的Par基因，如果扩增出现960bp片段和140bp片段则为性病亚种，如果仅有960bp为胎儿亚种。但是对龟亚种目前仅能通过对16SRNA测序然后在Genbank数据库中比对，以及通过MALDI-TOFMS取得峰图跟标准菌株比对后确定是否为龟亚种，但目前尚没有对龟亚种的普通PCR鉴定方法。本申请人在2014年8月29日已申请专利技术专利“一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒”(专利号：CN201410437158.5)。该专利涉及的试剂盒仅能鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种，检测的是胎儿弯曲菌的sap保守基因和性病亚种的par基因，而不能对龟亚种进行检测。当时尚未有国际权威期刊对龟亚种的定义。目前对胎儿弯曲菌龟亚种没有通过核酸的快速检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒。本专利技术所述的检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒包括：以胎儿弯曲菌龟亚种的COA基因作为靶基因设计的正向引物和反向引物。根据本专利技术所述的检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒的进一步特征，所述以COA基因为靶基因设计的正向引物的序列为SEQIDNO.1，反向引物的序列为SEQIDNO.2。本专利技术所述的检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒是用于检测龟亚种的COA基因，此基因在胎儿亚种和性病亚种均不存在，因此本专利技术所述的试剂盒不仅可以检测龟亚种，还可用来区分龟亚种和胎儿亚种、性病亚种。附图说明图1是本专利技术所述的PCR试剂盒的PCR产物电泳图，泳道1-7分别为1:10-1:106稀释度的PCR产物。图2是本专利技术所述的PCR试剂盒的特异性实验PCR产物电泳图。具体实施方式以下通过具体实施例并结合附图对本专利技术进行详细说明。1.引物设计选择胎儿弯曲菌龟亚种的COA基因作为靶基因，设计PCT扩增引物(见表1)。表1：扩增COA基因的引物序列引物序列(5’-3’)序列编号正向引物ACATAGCCGTAGTTGGATTTAGTASEQIDNO:1反向引物CCTCGGCTTTTTGCTTCASEQIDNO:2注：COA基因的扩增片段长度为294bp。2.PCR反应体系和PCR扩增程序反应体系：50μL反应体系(PCRmix25μL，正向引物(10μM/L)1μL，反向引物(10μM/L)1μL，ddH2O21μL，DNA2μL)。反应条件：预变性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳：1％琼脂糖凝胶，120V电泳60min，染色后紫外成像在294bp处片段即为阳性。3.灵敏度实验将标准菌株(ATCCBAA-2539)新鲜菌落用10mlPBS稀释成均匀的菌悬液，并梯度稀释成1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106等6个稀释度的菌悬液。3.1每个稀释度菌落计数。分别取每个稀释度的菌悬液100μl均匀涂抹在血平板上(每个稀释度同时做一个平行样)，然后将血平板在37℃微需氧培养箱培养3天后，对血平板上的弯曲菌菌落分别计数。并参照《GB4789.2-2006》计算出菌悬液的浓度。3.2每个稀释度提取核酸及PCR。取每个稀释度100μl，95℃加热10min，12000rpm离心2min，上清液即为待用模板。每个稀释度的模板按照前述反应体系PCR。3.3取5μlPCR反应产物在1％琼脂糖凝胶100V电泳70min后照相。3.4结果：PCR产物电泳图见图1；经计算该PCR方法检测灵敏度为9.7CFU/μl(见表2)。表2：胎儿弯曲菌龟亚种(ATCCBAA-2539)多个稀释度的PCR结果稀释度菌落数量(CFU/100μl)PCR结果1:10多不可计+1:102多不可计+1:103多不可计+1:10497-1:1058-1:1060-4.特异性实验4.1将表3的菌株用脑心浸液肉汤复苏增菌培养，取菌液1ml，12000rpm离心2min，去掉上清液，加入50μlDNA提取液，95℃10min，12000rpm离心2min，上清液即为待检用模板。4.2取上述模板2μl按照本试剂盒的反应体系及反应条件进行PCR扩增，扩增结束后取5μlPCR产物在1％琼脂糖凝胶100V电泳70min后照相(见图2)。4.38株胎儿弯曲菌龟亚种PCR产物电泳后在300bp位置出现明显条带，结果均为阳性。而其他27株其他细菌和阴性对照在300bp位置未出现条带，结果均为阴性，特异性为100％。表3：特异性实验用的菌株及PCR检测结果胎儿弯曲菌龟亚种检测方法的特异性实验PCR产物电泳结果见图2。5.结论本专利技术建立了一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒，检测灵敏度为9.7CFU/μl，特异性为100％，可应用于临床对胎儿弯曲菌龟亚种菌株进行快速准确的鉴定。SEQUENCELISTING<110>广州市疾病预防控制中心<120>一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒<130><160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>1acatagccgtagttggatttagta24<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2cctcggctttttgcttca18本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒，其特征在于，包括：以胎儿弯曲菌龟亚种的COA基因作为靶基因设计的正向引物和反向引物。

【技术特征摘要】
1.一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的PCR试剂盒，其特征在于，包括：以胎儿弯曲菌龟亚种的COA基因作为靶基因设计的正向引物和反向引物。2.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯水平，吴新伟，张周斌，杨智聪，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心广州市卫生检验中心，
类型：发明
国别省市：广东,44